肺癌是当今世界各国常见的呼吸道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈持续上升趋势。肺癌的病理分类中,75%～85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),治疗方法以手术切除为主,但肿瘤在术后复发和转移仍然是肺癌患者死亡的主要原因。19世纪80年代,有学者发现手术可促进肿瘤的生长和转移能力,并注意到肿瘤患者术后复发和转移的现象。近年来,人们逐渐认识到麻醉药物和麻醉方法也可影响到肿瘤患者的术后转归和长期预后。如何在围术期抑制肿瘤细胞的进一步发展和转移是麻醉医师面临的新挑战,正成为麻醉学研究的新课题。麻醉医师应选择具有抑制肿瘤细胞生长和转移能力的麻醉药或麻醉方法,以降低肿瘤在术后复发和转移的几率。七氟醚是肺癌手术期间广泛使用的吸入麻醉药物,其以气体形式通过呼吸道进入人体内发挥麻醉作用,具有麻醉效能强、可控性高的特点。因此,七氟醚在全身麻醉中,特别是在麻醉维持过程中占据着重要地位。肺癌手术时间相对较长,患者需长时间地接受吸入麻醉。七氟醚进入呼吸道后,首先与支气管、肺泡直接接触,但七氟醚对肺癌细胞的生长、转移能力及化疗敏感性有何影响尚不明确。肿瘤的生长是一个多基因、多阶段的复杂过程,其中细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡失调是肿瘤形成的原因之一。X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitorof apoptosis protein, XIAP)和Survivin属凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)成员,在肿瘤细胞增殖和凋亡过程中起着重要作用。研究证实,XIAP和Survivn能直接阻止天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific protease-3, Caspase-3)的合成。它们表达的下调能促进Caspase-3生成,诱导细胞发生凋亡。Bcl-2和Bax是Bcl-2蛋白家族成员,其中Bcl-2为抗凋亡成员,而Bax为促凋亡成员。Bcl-2和Bax之间的相互作用结果可决定细胞是否通过线粒体途径发生凋亡。目前,七氟醚对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及对上述分子表达有何影响尚不明确。肿瘤的生长还与细胞周期调控机制异常有关。肿瘤属于一种细胞周期调控机制发生紊乱的疾病,大多数肿瘤的发生和发展与细胞周期的调控异常密切相关。细胞周期受多种细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)调控,其中Cyclin A, Cyclin B1,Cdc2在调节细胞周期的G2/M期进展过程中发挥着重要作用。上述周期蛋白表达异常可导致细胞周期G2/M期调控失常,使细胞发生癌变。目前,七氟醚对人肺腺癌A549细胞的细胞周期及Cyclin A, Cyclin B1,Cdc2表达有何影响尚未见报道。肿瘤的转移是一个复杂、持续、多步骤、多阶段的过程。其中,肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是决定肿瘤细胞能否发生转移的两个较为重要因素。在肿瘤的基本转移过程中,肿瘤细胞首先通过膜表面受体粘附于基底膜(basement membrane, BM)和细胞外基质(extracellula matrix, ECM)成分,然后分泌蛋白水解酶侵袭BM和ECM,最后定向运动、迁移穿越BM和ECM,并经血道和淋巴道向远处迁移,在新的位置形成转移灶。MMP (matrix metalloproteinases, MMP)-2和MMP-9是由肿瘤细胞分泌的一类能降解BM和ECM的蛋白水解酶,同属基质金属蛋白酶家族,在肿瘤细胞侵袭过程中起着关键性作用；肿瘤细胞表达的Fasci、Ezrin能促进细胞的运动能力,与肿瘤细胞的迁移过程密切相关。目前,七氟醚对人肺腺癌A549细胞转移能力及上述相关分子的表达有何影响尚不明确。p38MAPK (p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)信号转导通路是MAPK家族的信号转导通路之一。大量研究证实,p38MAPK信号转导通路参与调控了肿瘤细胞的转移。但p38MAPK信号转导通路是否参与调控七氟醚对A549细胞转移能力的影响,以及是否参与调控七氟醚对MMP.2.MMP-9. Fascin. Ezrin表达的影响尚不明确。化疗已作为常规方案列入肺癌的综合治疗,对降低肿瘤术后复发和转移的几率有一定积极意义。近年来,随着肺癌患者在围术期使用铂类药物化疗愈来愈普遍,麻醉药物是否会影响化疗药物的效果也日渐受到关注。研究表明,七氟醚可减弱顺铂对艾氏腹水肿瘤细胞的毒性作用,但七氟醚是否会影响顺铂对人肺腺癌A549细胞的抗癌效应尚不明确。本研究采用七氟醚作用于体外培养的人肺腺癌A549细胞,并对以下三个方面进行研究：①探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞生长的影响及有关分子机制；②探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞转移能力的影响及有关分子机制；③探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响及有关分子机制。阐明上述问题将为临床麻醉工作提供一定指导意义。第一章七氟醚对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及有关分子表达的影响目的观察不同浓度七氟醚对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响,并探讨有关分子机制。方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后,随机分为4组：对照组(C组,0%七氟醚)、1.7%七氟醚组(S1组)、3.4%七氟醚组(S2组)、5.1%七氟醚组(S3组)。S1、S2、S3组的A549细胞分别用1.7%、3.4%、5.1%七氟醚处理2、4、6h。C组不接受七氟醚处理。四组处理结束后,继续培养48h。于48h时,采用MTT法、平板克隆实验、流式细胞仪分别检测各组A549细胞处理2、4、6h后的增殖抑制率、克隆形成率、凋亡率。免疫印迹法检测各组A549细胞处理4h的XIAP,Survivin,Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白表达水平。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,增殖抑制率、克隆形成率、细胞凋亡率的比较采用两因素析因设计方差分析。XIAP、Survivin、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的组间比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组A549细胞增殖抑制率的比较。经析因分析发现,七氟醚处理浓度各组间增殖抑制率的差异有统计学意义(F=128.672,P=0.000)。七氟醚处理时间各组间增殖抑制率的差异有统计学意义(F=135.426,P=0.000)。七氟醚处理浓度与七氟醚处理时间这两个因素无交互效应(F=1.854,P=0.135)。各个处理时间的S2、S3组增殖抑制率均高于S1组(P<0.05),其中S3组>S2组(P<0.05)。S1、S2、S3组处理6h的增殖抑制率>处理4h的增殖抑制率>处理2h的增殖抑制率(P<0.05)。C组各个处理时间的A549细胞增殖抑制率均为0。2.各组A549细胞克隆形成率的比较。经析因分析发现,七氟醚处理浓度各组间克隆形成率的差异有统计学意义(F=400.176,P=0.000)。七氟醚处理时间各组间克隆形成率的差异有统计学意义(F=65.728,P=0.000)。七氟醚处理浓度与七氟醚处理时间这两个因素存在交互效应(F=6.081,P=0.000)。七氟醚处理浓度的单独效应分析显示：与C组比较,各个处理时间的S1、S2、S3组克隆形成率依次降低(P<0.05)；七氟醚处理时间的单独效应分析显示：S1、S2、S3组处理6h的克隆形成率<处理4h的克隆形成率<处理2h的克隆形成率(P<0.05),C组各个处理时间的克隆形成率比较无显著差异(P>0.05)3.各组A549细胞凋亡率的比较。经析因分析发现,七氟醚处理浓度各组间凋亡率的差异有统计学意义(F=278.064,P=0.000)。七氟醚处理时间各组间凋亡率的差异有统计学意义(F=94.230,P=0.000)。七氟醚处理浓度与七氟醚处理时间这两个因素存在交互效应(F=11.440,P=0.000)。七氟醚处理浓度的单独效应分析显示：与c组比较,各个处理时间的S1、S2、S3组细胞凋亡率均依次增加(P<0.05)；七氟醚处理时间的单独效应分析显示：S1、S2、S3组处理6h的细胞凋亡率>处理4h的细胞凋亡率>处理2h的细胞凋亡率(P<0.05),C组各个处理时间的细胞凋亡率比较无显著差异(P>0.05)。4.各组A549细胞XIAP, Survivin, Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的比较。与C组比较,S1、S2、S3组XIAP, Survivin蛋白表达依次下调(P<0.05)与C组比较,S1、S2、S3组Cleaved Caspase-3蛋白表达依次上调(P<0.05)5.各组A549细胞Bcl-2, Bax蛋白表达水平的比较。与C组比较,S1、S2、S3组Bcl-2, Bax蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。结论七氟醚能抑制A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡。该效应与下调XIAP、urvivin蛋白表达,上调Cleaved Caspase-3蛋白表达有关。第二章七氟醚对人肺腺癌A549细胞的细胞周期及有关分子表达的影响目的观察不同浓度七氟醚对人肺腺癌A549细胞的细胞周期影响,并探讨有关分子机制。方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后,随机分为对照组(C组,0%七氟醚)、1.7%七氟醚组(S1组)、3.4%七氟醚组(S2组)、5.1%七氟醚组(S3组)。S1、S2、S3组的A549细胞分别用1.7%、3.4%、5.1%七氟醚处理4h。C组不接受七氟醚处理。四组处理结束后,继续培养48h。于48h时,采用流式细胞仪检测各组A549细胞的细胞周期比例变化。免疫印迹法检测各组A549细胞处理4h后的Cyclin A, Cyclin B1, Cdc2蛋白的表达水平。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组A549细胞的细胞周期变化的比较。与C组比较,S1、S2、S3组G0/G1期细胞比例依次降低(P<0.05),S期和G2/M期细胞比例依次增加(P<0.05)。2.各组A549细胞Cyclin A, Cyclin B1, Cdc2蛋白表达水平的比较。与C组比较,S1、S2、S3组Cyclin A, Cyclin B1, Cdc2蛋白表达依次下调(P<0.05)结论七氟醚阻滞A549细胞的细胞周期于G2/M期,该效应与下调Cyclin A, Cyclin B1,Cdc2蛋白表达有关。第三章七氟醚对人肺腺癌A549细胞转移能力及有关分子表达的影响目的观察不同浓度七氟醚对人肺腺癌A549细胞转移能力的影响,并探讨有关分子机制。方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后,随机分为4组：对照组(C组,0%七氟醚)、1.7%七氟醚组(S1组)、3.4%七氟醚组(S2组)、5.1%七氟醚组(S3组)。S1、S2、S3组的A549细胞分别用1.7%、3.4%、5.1%七氟醚处理2、4、6h。C组不接受七氟醚处理。四组处理结束后,继续培养24h。于24h时,采用Transwell法检测各组细胞处理2、4、6h后的侵袭细胞数,细胞划痕实验检测各组细胞处理4h后的细胞迁移率变化,RT-PCR和免疫印迹法检测各组细胞处理4h后MMP-2、MMP-9、Fascin、Ezrin的mRNA和蛋白表达水平。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,侵袭细胞数的比较采用两因素析因设计方差分析。细胞迁移率、MMP-2、MMP-9、Ezrin、Fascin mRNA和蛋白表达的组间比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组A549细胞侵袭细胞数的比较。经析因分析发现,七氟醚处理浓度各组间侵袭细胞数的差异有统计学意义(F=241.554,P=0.000)。七氟醚处理时间各组间侵袭细胞数的差异有统计学意义(F=31.188,P=0.000)。七氟醚处理浓度与七氟醚处理时间这两个因素存在交互效应(F=3.801,P=0.003)。七氟醚处理浓度的单独效应分析显示：与C组比较,各个处理时间的S1、S2、S3组侵袭细胞数依次减少(P<0.05)；七氟醚处理时间的单独效应分析显示：S1、S2、S3组处理6h的侵袭细胞数<处理4h的侵袭细胞数<处理2h的侵袭细胞数(P<0.05),C组各个处理时间的侵袭细胞数比较无显著差异(P>0.05)2.各组A549细胞MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达水平的比较。与C组比较,S1、S2、S3组MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达依次下调(P<0.05)。3.各组A549细胞迁移率的比较。与C组比较,S1组细胞迁移率无统计学差异(P=0.134)。与C组比较,S2、S3组细胞迁移率依次降低(P<0.05)。4.各组A549细胞Fascin、Ezrin mRNA和蛋白表达水平的比较。与C组比较,S1、S2、S3组Fasch、Ezrin mRNA和蛋白表达依次下调(P<0.05)。结论七氟醚能抑制A549细胞侵袭,该效应与下调MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达有关；七氟醚能抑制A549细胞迁移,该效应与下调Fascin、Ezrin mRNA和蛋白表达有关。第四章p38MAPK信号转导通路在七氟醚抑制人肺腺癌A549细胞转移能力中的作用目的探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞转移能力的抑制作用是否与p38MAPK信号转导通路有关。方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后A549细胞随机分为对照组(C组)、3.4%七氟醚组(Sev组)、3.4%七氟醚+SB203580组(Sev+SB组)、SB203580组(SB组)。Sev组暴露于3.4%七氟醚4h。Sev+SB组先与20μMSB203580孵育,随后暴露于3.4%七氟醚4h。SB组用SB203580处理。C组不接受七氟醚和SB203580处理。四组处理结束后,继续培养24h。于24h时,采用Transwell法检测各组细胞处理后的侵袭细胞数,细胞划痕实验检测各组细胞处理后的细胞迁移率变化,蛋白印迹法检测各组细胞处理后p38MAPK、 p-p38MAPK、UMP-2、MMP-9、Ezrin Fascin的蛋白表达水平。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用两因素析因设计方差分析,组间多重比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组A549细胞侵袭细胞数的比较。析因分析发现,七氟醚处理后侵袭细胞数显著减少(F=87.188,P=0.000)。SB203580处理后侵袭细胞数目显著减少(F=124.866,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=15.840,P=0.001)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组侵袭细胞数目显著减少(P<0.05)。Sev+SB组侵袭细胞数目显著低于其他3组(P<0.05)2.各组A549细胞迁移率的比较。析因分析发现,七氟醚处理后细胞迁移率显著降低(F=79.419,P=0.000)。SB203580处理后细胞迁移率显著降低(F=84.304,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=33.305,P=0.000)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组的细胞迁移率显著降低(P<0.05)。Sev+SB组的细胞迁移率显著低于其他3组(P<0.05)。3.各组A549细胞p38MAPK磷酸化水平的比较。析因分析发现,七氟醚处理后p38MAPK磷酸化水平显著降低(F=51.124,P=0.000)。SB203580处理后p38MAPK磷酸化水平显著降低(F=82.749,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=5.463,P=0.03)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组p38MAPK磷酸化水平显著降低(P<0.05)。Sev+SB组p38MAPK磷酸化水平显著低于其他3组(P<0.05)。4.各组A549细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的比较。MMP-2蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后MMP-2表达显著下调(F=103.042,P=0.000)。SB203580处理后MMP-2蛋白表达显著下调(F=243.337,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=5.656,P=0.027)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组MMP-2蛋白表达显著下调(P<0.05)Sev+SB组MMP-2蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)；MMP-9蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后MMP-9蛋白表达显著下调(F=88.369,P=0.000)。SB203580处理后MMP-9蛋白表达显著下调(F=271.388,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=5.968,P=0.024)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组MMP-9蛋白表达显著下调(P<0.05)。Sev+SB组MMP-9蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)5.各组A549细胞Fascin、Ezrin蛋白表达的比较。Fascin蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后Fascin蛋白表达显著下调(F＝104.422,P=0.000)。SB203580处理后Fascin蛋白表达显著下调(F=364.239,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=10.168,P=0.005)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组Fascin蛋白表达显著下调(P<0.05)。Sev+SB组Fascin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)；Ezrin蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后Ezrin蛋白表达显著下调(F=78.411,P=0.000)。SB203580处理后Ezrin蛋白表达显著下调(F=169.365,P=0.000)。七氟醚和SB203580这两个处理因素之间存在着交互效应(F=21.122,P=0.000)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、SB组Ezrin蛋白表达显著下调(P<0.05)Sev+SB组Ezrin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)结论七氟醚抑制A549细胞侵袭和迁移的作用可能与抑制p38MAPK信号转导通路有关。第五章七氟醚对人肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响目的观察七氟醚对人肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响及探讨有关分子机制。方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后A549细胞随机分为对照组(C组)、2.5%七氟醚组(Sev组)、顺铂组(DDP组)、2.5%七氟醚+顺铂组(Sev+DDP组)。Sev组暴露于2.5%七氟醚4h,DDP组接受终浓度为10μmol/L顺铂的处理。Sev+DDP组A549细胞加入终浓度为10μmol/L顺铂,再暴露于2.5%七氟醚4h。C组不接受七氟醚和DDP处理。四组处理结束后,继续培养24h。于24h时,采用Transwell法检测各组细胞处理后的侵袭细胞数,细胞划痕实验检测各组细胞处理后的细胞迁移率变化,蛋白印迹法检测各组细胞处理后MMP-2、MMP-9、Ezrin、Fascin蛋白表达水平。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用两因素析因设计方差分析,组间多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组A549细胞侵袭数的比较。析因分析发现,七氟醚处理后侵袭细胞数显著减少(F=80.695,P=0.000)。DDP处理后侵袭细胞数显著减少(F=127.681,P=0.000)。七氟醚和DDP这两个处理因素之间存在着交互效应(F=7.871,P=0.011)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、DDP组侵袭细胞数目显著减少(P<0.05)。Sev+DDP组侵袭细胞数目显著低于其他3组(P<0.05)。2.各组A549细胞MMP-2、MMP-9表达的变化。 MMP-2蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后MMP-2蛋白表达显著下调(F=68.510,P=0.000)。DDP处理后MMP-2蛋白表达显著下调(F=205.571,P=0.000)。七氟醚和DDP这两个处理因素之间存在着交互效应(F--8.351,P=0.009)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、DDP组MMP-2蛋白表达下调(P<0.05)。Sev+DDP组MMP-2蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)； MMP-9蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后MMP-9蛋白表达显著下调(F=86.277,P=0.000)。DDP处理后MMP-9蛋白表达显著下调(F=365.709,P=0.000)。七氟醚和DDP这两个处理因素之间存在着交互效应(F=18.754,P=0.000)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、DDP组MMP-9蛋白表达下调(P<0.05)。Sev+DDP组MMP-9蛋白表达显著低于其他3组。3.各组A549细胞迁移率的比较。析因分析发现,七氟醚处理后细胞迁移率显著降低(F=133.671,P=0.000)。DDP处理后细胞迁移率显著降低(F=209.764,P=0.000)。七氟醚和DDP这两个处理因素之间存在着交互效应(F=54.888,P=0.000)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、DDP组的细胞迁移率显著降低(P<0.05)。Sev+DDP组的细胞迁移率显著低于其他3组(P<0.05)4.各组A549细胞Ezrin、Fascin蛋白表达的变化。Ezrin蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后Ezrin蛋白表达显著下调(F=74.205,P=0.000)。DDP处理后Ezrin蛋白表达显著下调(F=282.359,P=0.000)。七氟醚和DDP这两个处理因素之间存在着交互效应(F=9.516,P=0.006)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、DDP组Ezrin蛋白表达下调(P<0.05)。Sev+DDP组Ezrin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)；Fascin蛋白表达比较：析因分析发现,七氟醚处理后Fascin蛋白表达显著下调(F=128.451,P=0.000)。DDP处理后Fascin蛋白表达显著下调(F=603.874,P=0.000)。七氟醚和DDP这两个处理因素之间存在着交互效应(F=52.328,P=0.000)。单向方差分析显示：与C组比较,Sev组、DDP组Fascin蛋白表达下调(P<0.05)。Sev+DDP组Fascin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)。结论七氟醚增强人肺腺癌A549细胞对顺铂的敏感性,促进其抑制A549细胞的侵袭、迁移行为,该效应分别与下调MMP-2、MMP-9、Ezrin、Fascin蛋白表达有关。