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近年来,以Alemtuzumab(CAMPATH-1H,人源化的CD52单克隆抗体)为基础联合术后低剂量FK506的免疫耐受诱导方案逐渐在临床小肠移植上推广开来,使小肠移植效果得到明显改善。CAMPATH-1抗体是由英国剑桥科学家Hale等人为控制骨髓移植术后移植物抗宿主病(gaft-versus-hostdisease,GVHD)在上世纪80年代初开发的,其能特异性识别淋巴细胞表面CD52抗原而发挥作用,后经过一系列改进发展成为今天临床应用的人源化CD52单克隆抗体即CAMPATH-1H。该抗体能通过补体依赖细胞介导的细胞毒作用、抗体依赖的细胞毒作用和诱导凋亡等途径迅速而强效的清除循环淋巴细胞(包括B、T淋巴细胞和巨噬细胞),并使其长期维持在较低水平,因此被逐渐引入实体器官移植领域,用于诱导免疫耐受。目前对于CD52单克隆抗体的认识多集中在其对循环淋巴细胞和干细胞的作用,而关于其对周围淋巴器官的影响知之甚少。肠道是人体内淋巴细胞含量最丰富的器官,其中肠上皮内淋巴细胞(intra-epithelial lymphocytes,IELs)是肠相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissue,GALT)中特别的一群,对维持肠道正常的内稳态发挥重要作用。因而CD52单抗对于肠道,特别是肠IELs的影响值得关注。虽然CD52抗原已在人类和其他多种动物体内被发现,但是已开始商业生产的CD52单抗只有两类:针对人和灵长类动物的人源化CD52单抗和抗小鼠CD52单抗,所以我们选择小鼠模型进行动物实验。本研究论文中,我们建立了小鼠异位和原位小肠移植模型,并在原位移植模型上观察CD52单抗对移植肠IELs和肠上皮紧密连接的影响,阐明CD52单抗对移植肠的作用,为全面深入了解CD52单抗并且进一步优化对其的使用提供理论依据。第一部分小鼠小肠移植模型的建立目的:建立稳定的小鼠异位和原位小肠移植模型,分析两种模型的特点,为后续研究选择合理的平台。方法:应用C57BL/6小鼠进行同基因系小肠移植。供体肠系膜上动脉和门静脉分别与受体腹主动脉和下腔静脉在肾血管水平以下行端侧吻合。异位移植保留受体小肠,采用非造瘘法,移植肠近端关闭,远端与自体回肠行端侧吻合。原位移植切除受体小肠,将移植肠两端分别与自体肠行端端吻合。观察术后体重变化,分析死亡原因,术后2周解剖,移植肠常规病理检查。结果:异位模型成功率为90.9%(30/33),原位模型成功率为78.4%(29/37),不可逆的低血容量性休克是受体死亡的主要原因;相对于异位移植,原位移植术后受体体重下降幅度更大,持续时间更长。术后2周解剖发现异位移植的小肠被旷置,肠管较细,小肠绒毛较短,而原位移植肠无上述改变。结论:两种模型均能稳定建立,但原位移植模型移植肠功能完整,更为合理。第二部分CD52单抗对小肠移植术后小鼠移植肠上皮内淋巴细胞的影响目的:观察CD52单抗对移植肠IELs及其亚群的影响。方法:采用小鼠原位小肠移植模型,以C57BL/6小鼠为受体,同基因系移植中C57BL/6小鼠为供体,而异基因系移植中BALB/c小鼠为供体,术后FK506控制排斥。实验共分6组:同基因移植正常对照组(C57BL/6);同基因移植-CD52组;同基因移植+CD52组;异基因移植正常对照组(BALB/c);异基因移植-CD52组;异基因移植+CD52组。移植小鼠分别在术后第7天或第14天取材,标本行组织病理学检查,提取移植肠IELs进行流式细胞分析,用real-time PCR法检测IELs 中角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)mRNA 的表达。结果:异位移植术后无排斥反应出现。术后第7天,应用CD52单抗的移植肠绒毛较短。流式细胞分析显示:移植术后第7天,应用CD52单抗后,IELs及其亚群细胞数量减少,而且TCRγδ+亚群减少更为明显;术后移植肠内供体来源的TCRγδ+ IELs逐渐被受体来源的细胞所替代;CD52单抗对主要清除供体来源的TCRγδ+ IELs。应用CD52单抗后,移植肠IELs中KGF mRNA表达下降。结论:CD52单克隆抗体对移植肠IELs具有清除作用,而且其对于TCRγδ+亚群作用较强,并降低KGF mRNA的表达,从而对移植肠产生不利影响。第三部分CD52单抗对小肠移植术后小鼠移植肠上皮紧密连接的影响目的:观察CD52单抗对移植肠紧密连接的影响。方法:采用小鼠原位小肠移植模型,以C57BL/6小鼠为受体,同基因系移植中C57BL/6小鼠为供体,而异基因系移植中BALB/c小鼠为供体,术后FK506控制排斥。实验共分4组:同基因移植-CD52组;同基因移植+CD52组;异基因移植-CD52组;异基因移植+CD52组。于术后第7天取材,透射电镜检查观察紧密连接结构,免疫荧光检查观察紧密连接蛋白Occludin和zona occludens 1(ZO-1)的在体分布,Western blot检测移植肠紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达。结果:应用CD52单抗后,电镜下紧密连接结构模糊,间隙增大;免疫荧光检查发现Occludin和ZO-1蛋白的荧光表达减少,部分绒毛顶端表达缺失;Western blot检查发现两种紧密连接蛋白表达均下降。结论:CD52单抗减少移植肠紧密连接蛋白的表达,破坏肠上皮紧密连接结构。