典型的核酸分子探针由核酸分子序列和信号转导部分组成。通过碱基互补配对、金属螯合作用、适配体捕获等方式实现对目标物的识别,并通过光、电、磁等信号来报告探针与目标的结合情况。其中光学核酸分子探针因其灵敏度高、检测对象广、检测手段灵活、不需要复杂仪器等特点,得到了科研工作者的广泛青睐和深入研究。金纳米粒子(AuNPs)具有良好的生物相容性,表面也比较容易进行生物修饰。AuNPs在紫外-可见区出现的表面等离子体共振吸收峰随着AuNPs的形状、粒子间距离、溶液介电常数及温度等因素的改变而变化,伴随着的是AuNPs溶液的颜色变化。目前基于AuNPs这种性质的比色法已广泛应用于无机金属离子、DNA、蛋白质、肿瘤细胞等生物样品的检测。然而一般来说,目标物对于核酸分子信号的触发是按1:1的方式进行的,这样限制了纳米金核酸分子探针检测目标物的灵敏度。随着疾病诊断水平的不断提高和科学研究的不断深入,发展一些高灵敏性和高特异性的方法来检测生物分子显得尤为重要。为此,本论文以纳米金核酸分子探针为工具,以细胞、汞离子(Hg2+)和端粒酶为检测目标,发展了一些新的信号放大技术,具体开展了以下几个方面的内容:1、信号双重放大策略用于癌细胞的高灵敏可视化检测我们构建了一种简便、直观的基于AuNPs分散/聚集的癌细胞比色检测新方法。在构建的比色传感器中,对HL-60细胞特异性识别的适配体DNA被修饰在磁珠上,而多种mDNA被预先组装在适配体DNA上。HL-60存在的条件下,适配体DNA与癌细胞表面蛋白结合产生形变,mDNA被释放出来,并在限制性内切酶存在的条件下对固定在另一种磁珠表面的DNA进行切割,产生大量的单链DNA(ssDNA),形成信号的双重放大。双重信号放大所产生的单链DNA和mDNA能够吸附在金球表面并产生排斥力,从而对盐环境中的AuNPs产生保护,使得AuNPs成分散状态,颜色为红色。反之,当溶液中没有癌细胞,AuNPs由于盐作用会产生团聚,溶液会变成蓝色,从而可以利用颜色的差别进行检测识别。我们采用了紫外吸收光谱来对缓冲液中的实验结果进行定量分析,发现紫外吸收峰比值(A525/A680)同HL-60细胞的数量的对数值在10-104范围内成线性关系,并计算出了检测限为4个HL-60细胞。同时,我们还在稀释的血清中重复了细胞检测实验,取得了比较好的重现结果。2、比色/荧光双模式汞离子的检测在本章工作中我们提出一个基于杂交链循环反应(HCR)和免标记AuNPs的高灵敏比色/荧光双模式传感器,来检测水样中的汞离子(Hg2+)。当溶液中没有Hg2+只有DNA探针,AuNPs的表面会被发卡DNA和ssDNA所覆盖。这些DNA保护的AuNPs会在盐溶液中保持分散状态,溶液为红色。同时,由于我们在其中的一种发卡DNA上修饰了荧光探针,荧光会随着DNA的吸附而被金球所猝灭。当溶液中存在目标Hg2+,辅助DNA与发卡DNA1会通过T-Hg2+-T的形式结合,从而触发HCR循环反应。形成的双链是刚性结构,并且带负电的碱基并不暴露在外侧,所以形成的产物不能够对AuNPs形成保护。在盐的作用下,AuNPs将发生团聚,溶液颜色变为蓝色。同时由于DNA与AuNPs没有吸附,荧光得以恢复。得益于HCR的放大效果,在低于100 mM盐浓度的条件下通过荧光和紫外检测我们能够分辨出0.1 nM的Hg2+,而通过肉眼观察颜色变化我们可以观察到1 nM的Hg2+所引起的颜色变化。在高盐环境下,例如工业废水等,荧光检测将是一个更好的选择。无论是荧光检测还是比色检测对于Hg2+都有着很好的检测选择性。在实际样的检测中,我们收集了湖水,并且用标准加入法在不同的盐浓度下对水样中的Hg2+进行了比色/荧光分析。3、基于酶放大的细胞中端粒酶活性的比色分析本章工作中结合分子信标技术和内切酶放大技术发展了一个简单、灵敏的细胞中端粒酶活性比色检测的新方法。在溶液中有两种DNA修饰的AuNPs,连接DNA(linker DNA)可以连接上述的两种金纳米粒子上,造成金纳米粒子的聚集,溶液颜色为紫色。在活性端粒酶的作用下,引物会扩增出特定重复序列(TTAGGG)n。由于一个底物延伸链可以打开不止一个分子信标,所以第一步打开多个分子信标是信号的一重放大。打开的分子信标可以同linker DNA杂交,并在剪切酶的作用下将linker DNA剪切,以此循环,为第二重放大。Linker DNA的剪切造成金球的分散,金纳米溶液颜色变为红色。得益于这两种放大技术的结合,在不借助PCR扩增的条件下最低可以检测到25个Hela细胞裂解液里面的端粒酶,是一种简便、灵敏的端粒酶活性可视化检测方法。