【摘 要】
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该文进行了以下研究：一.t-PA cDNA基因的克隆;从培养的人黑色素瘤细胞（Bowes细胞系）中提取总RNA,反转录得到t-PA cDNA的第一条链,然后通过RT-PCR扩增获得了约为2.3kb的t-PA cDNA
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该文进行了以下研究：一.t-PA cDNA基因的克隆;从培养的人黑色素瘤细胞（Bowes细胞系）中提取总RNA,反转录得到t-PA cDNA的第一条链,然后通过RT-PCR扩增获得了约为2.3kb的t-PA cDNA并将PCR产物连接到Pgemt-easy载体中,根据序列测定的结果,对PCR过程中出现的点突变进行纠正.二.r-PA cDNA基因的克隆;通过合理的引物设计,以t-PA基因为模板,通过PCR的方法进行缺失突变,将t-PA cDNA中编码第4-175位氨基酸的碱基序列去掉,将PCR产物连接到pMD18-T载体中并进行DNA序列测定,测序结果与文献报道完全一致.三.大肠杆菌表达载体的构建;Pet28a载体和r-PA基因分别用核酸内酶切割后,回收目的片段并用T<,4>连接酶连接.构建了大肠杆菌表达载体r-PA/pET.四.r-PA的原核表达及培养条件的优化;原核表达载体r-PA/pET转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳,在39kD处有蛋白带出现,与文献报道的r-PA的分子量一致.联合使用溶菌酶及超声波法破除细胞壁,离心收集包涵体.用6M的盐酸胍使包涵体变性溶解,将变性后的r-PA溶液加入到含有谷胱甘肽的复性缓冲液中使r-PA重新折叠成活性形式.七.基因枪法构建基因海带;用上述构建的两种质粒通过基因枪轰击转化海带的雌配子体,雌配子体通过孤雌生长形成新的海带株,通过β-半乳糖苷酶检测系统和除草剂Basta的作用就可以筛选出带有r-PA基因的转化海带株.
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