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研究背景：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)的严重并发症之一,也是导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因,主要以系膜细胞增殖和细胞外基质(ECM)蛋白和肾小管基底膜的过度积累引起的肾小球系膜增生、蛋白尿以及进行性肾功能不全为特点,并最终进展成为肾小球硬化及肾小管间质纤维化。高血糖对肾脏细胞有明显的损伤作用。在不同肾脏细胞中,高糖可激活多种信号转导通路,刺激细胞因子的产生。体外和体内研究表明,转化生长因子-β1 (TGF-β1),血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)在DN以及肾小球硬化症的发生、发展过程中发挥重要作用。AngⅡ是肾素血管紧张素系统(RAS)的主要效应分子,在高糖所致的肾脏损害中起到重要作用。缬沙坦(Valsartan, Val)作为AT1受体拮抗剂,目前已经成为治疗DN的一线药物。本研究通过离体灌流肾脏(isolated perfused kidney, IPK)模型和体外细胞培养方法,探索研究高糖和缬沙坦对TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三种细胞因子表达的影响及其表达的先后顺序,为DN的发生机制提供理论依据。实验方法：本实验采用离体灌流肾脏和系膜细胞两种模型,分别观察高糖(30.0mmol/L)和缬沙坦(10-6mol/L)在0.5h,1h,2h,4h和6h时对TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三种细胞因子表达的影响。第一部分高糖对离体大鼠肾脏灌流时细胞因子的影响及缬沙坦的干预作用将离体肾脏置于37℃恒温浴槽里持续灌流,灌流液分为对照组(葡萄糖10.0mmol/L),高糖组(葡萄糖30.0mmol/L)和缬沙坦组(葡萄糖30.0mmol/L+缬沙坦10-6mol/L)。灌流压80mmHg,灌流量10ml/min,搜集灌流开始后0.5h,1h,2h,4h和6h时的尿液并记录尿量。1.高糖对大鼠IPK肾功能的影响及缬沙坦的干预作用灌流结束后,取肾组织进行常规石蜡切片,HE染色,观察肾脏组织形态。采用试剂盒测定尿液样本中的肌苷、LDH以及钾离子浓度指标。2.高糖对大鼠IPK细胞因子的影响及缬沙坦的干预作用：肾组织切片采用免疫组织化学染色法观察高糖和缬沙坦对TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三种细胞因子表达的影响。第二部分高糖对大鼠系膜细胞细胞因子的影响及缬沙坦的干预作用取对数生长期系膜细胞,消化后按1×104／ml／孔接种于24孔板,将灭菌的盖玻片放入培养板的孔内,赖氨酸包被后,使细胞爬片。常规培养24h后,换无血清培养24h,使细胞同步于G0期,分为：对照组(葡萄糖10.0mmol/L),高糖组(葡萄糖30.0mmol/L)和缬沙坦组(葡萄糖30.0mmol/L+缬沙坦10-6mol/L)。分别于培养0.5h, 1h,2h,4h和6h后,采用免疫细胞化学染色法观察高糖和缬沙坦对体外培养的系膜细胞中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三种细胞因子的表达。采用ELISA法观察高糖和缬沙坦对体外培养的系膜细胞中TGF-β1的含量。采用RT-PCR法观察高糖和缬沙坦对体外培养的系膜细胞中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三种细胞因子mRNA表达的影响。实验结果：第一部分高糖对离体大鼠肾脏灌流时细胞因子的影响及缬沙坦的干预作用1.高糖对大鼠IPK肾功能的影响及缬沙坦的干预作用1.1肾组织形态学观察：高糖组中,肾组织形态受损情况较对照组严重,随着灌流时间的延长,受损情况加重；缬沙坦组中,肾组织受损情况较高糖组有所改善。1.2肾功能检测指标测定：对照组中,随着灌流时间的延长,尿量、尿液中肌苷、LDH以及钾离子浓度值均有所降低；高糖组中,与对照组比较,尿量、尿液中肌苷、LDH以及钾离子浓度值降低的趋势更为明显；缬沙坦组中,与高糖组比较,尿量、尿液中肌苷、LDH以及钾离子浓度值降低的情况得到明显改善。2.高糖对大鼠IPK细胞因子的影响及缬沙坦的干预作用2.1对大鼠IPK中TGF-β1蛋白表达的影响：免疫组织化学结果显示,高糖可刺激大鼠IPK中TGF-β1蛋白的表达,在灌流4h时TGF-β1蛋白的表达水平有所下降,在灌流6h时,TGF-β1蛋白的表达量有所回升；缬沙坦进行干预后,TGF-β1蛋白的表达水平受到抑制。2.2对大鼠IPK中VEGF蛋白表达的影响：免疫组织化学结果显示,高糖可刺激大鼠IPK中VEGF蛋白的表达,在灌流开始2h内,VEGF在离体灌流肾脏中的表达量明显高于对照组,灌流2h后,VEGF的表达量有所下降,略高于对照组；缬沙坦进行干预后,VEGF蛋白的表达水平受到抑制。2.3对大鼠IPK中PDGF-BB蛋白表达的影响：免疫组织化学结果显示,对照组中,PDGF-BB在离体灌流肾脏中的表达水平逐渐下降；高糖组中,PDGF-BB的表达水平逐渐下降,但高于对照组,在灌流6h时,表达水平有所回升；缬沙坦进行干预后,PDGF-BB蛋白的表达水平明显低于高糖组。第二部分高糖对大鼠系膜细胞细胞因子的影响及缬沙坦的干预作用1.高糖对系膜细胞细胞因子蛋白表达的影响及缬沙坦的干预作用1.1对大鼠系膜细胞TGF-β1蛋白表达的影响：免疫细胞化学结果显示,正常系膜细胞中,TGF-β1随着培养时间的延长表达增强；在系膜细胞开始培养2h内,高糖可促使TGF-β1蛋白表达增加,培养2h后,TGF-β1的表达水平有所下降,6h时,TGF-β1的表达水平有所有所回升,但与对照组相差不大；缬沙坦进行干预后,TGF-β1蛋白的表达水平受到抑制。采用ELISA法检测高糖和缬沙坦条件下,体外培养的系膜细胞细胞液中TGF-β1的含量,结果显示：在高糖刺激下,系膜细胞分泌TGF-β1较对照组有所增多,在6h时系膜细胞分泌TGF-β1减少,并低于对照组；加入缬沙坦干预后,系膜细胞分泌TGF-β1明显减少,尤其是在培养2h和4h时。1.2对大鼠系膜细胞VEGF蛋白表达的影响：免疫细胞化学结果显示,正常系膜细胞中,VEGF随着培养时间的延长表达增强；在系膜细胞培养0.5h、1h和2h时,高糖可促使VEGF的表达水平逐渐增加,在培养4h和6h时,VEGF的表达水平有所下降,但均高于对照组的表达水平；缬沙坦进行干预后,VEGF蛋白的表达水平明显低于高糖组,并具有显著性差异。1.3对大鼠系膜细胞PDGF-BB蛋白表达的影响：免疫细胞化学结果显示,在对照组中,PDGF-BB在大鼠系膜细胞中有所表达,且随着培养时间的延长表达增强；高糖刺激PDGF-BB在大鼠系膜细胞中的表达量增加,其表达水平略高于对照组,但无显著性差异；缬沙坦进行干预后,PDGF-BB蛋白的表达水平受到抑制。2.高糖对系膜细胞细胞因子mRNA表达的影响及缬沙坦的干预作用：RT-PCR结果显示,高糖可促进TGF-β1、VEGF和PDGF-BB mRNA的表达,加入缬沙坦后,高糖的刺激作用受到抑制。在培养开始时,TGF-β1 mRNA表达水平较高,VEGF和PDGF-BB mRNA表达水平较低,但随着培养时间的延长,VEGF和PDGF-BB mRNA表达逐渐加强,而TGF-β1 mRNA表达水平有降低的趋势。结论：高糖可以引起离体灌流肾脏功能损伤,使尿量减少、肌酐清除率降低、LDH活性下降,缬沙坦可明显改善高糖所致离体灌流肾脏功能的损伤。高糖可以刺激离体灌流肾脏和体外系膜细胞培养中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB的表达,且TGF-β1先于VEGF和PDGF-BB表达。缬沙坦可以抑制高糖所致的TGF-β1、VEGF和PDGF-BB表达的增加,使系膜细胞细胞液中TGF-β1含量减少。本研究通过离体肾脏灌流模型和体外细胞培养方法,观察了高糖刺激的早期对肾脏和系膜细胞中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB的影响,为临床上预防、治疗DN的发生、发展提供了理论依据。