急性肾损伤(AKI)的发病率日益增加,部分患者通过治疗后其症状消失,但肾脏却是不完全修复,在多年后会进展为慢性肾脏病(CKD)。据最新报道显示,AKI患者日后进展为慢性肾脏病的风险高达25.8%,发展至终末期肾衰竭的风险也有8.6%。在急性肾损伤至慢性肾纤维化的发生发展过程中,炎症的级联放大作用、成纤维细胞的活化增殖并分泌细胞外基质等均发挥了重要作用,如若能抑制其进展过程中的这些反应,将大大减少AKI患者发展至CKD的比例。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中提取出的多酚类化合物,具有极强的抗氧化、清除氧自由基、抗炎等作用。联想到急性肾损伤和慢性肾纤维化均与炎症有关,本实验将GSPE应用到小鼠急性肾损伤及慢性肾纤维化模型中,结果发现,GSPE不仅可以减轻AKI时的肾小管损伤、间质炎症,对慢性肾纤维化也有着一定的抑制作用。在肾脏损伤后激发炎症的触发蛋白中,我们发现高迁移率族蛋白(HMGB1)的作用尤为重要,它是一种广泛存在于有核细胞胞核上的高度保守的DNA结合蛋白,一旦被释放至胞外,即可启动免疫反应,在肾脏,HMGB1既可由损伤坏死的肾小管上皮细胞被动分泌,也可由浸润的炎症细胞主动分泌。在急性肾损伤后,GSPE抑制了 HMGB1的胞浆核转移,减少了其下游P65的活化,从而减轻了肾间质炎症,同时在慢性肾纤维化的进展过程中,GSPE对HMGB1及其下游信号通路也有一定的抑制作用,但没有急性肾损伤时明显,因此我们考虑到GSPE可能还从其他方面影响了肾间质纤维化。成纤维细胞的活化增殖在慢性肾纤维化中亦起到了不可忽略的作用,通过体外培养NRK-49F细胞系,给予TGF-β刺激以及GSPE干预后发现,GSPE通过抑制TGF-β下游经典的Smad和非经典的JNK信号途径而减少了 NRK-49F细胞分泌细胞外基质。综上所述,GSPE可以通过抑制炎症的爆发而减轻急性肾损伤,但却可通过抑制炎症和成纤维细胞活化来减轻慢性肾间质纤维化。第一部分GSPE在急性肾损伤中的作用及其机制的研究目的探讨GSPE在急性肾损伤模型中所起的作用及其机制。方法将6周大小的C57BL/6雄性小鼠分为假手术组、单纯给予GSPE组、双侧缺血再灌注(I/R)+PBS组、双侧I/R+不同浓度GSPE组等。通过灌胃在手术前连续给予小鼠PBS以及不同浓度的GSPE5天后,在37℃条件下,夹闭小鼠双侧肾脏30分钟,24小时后提取小鼠血液及肾脏标本。检测小鼠血肌酐和尿素氮水平,用PAS和Tunnel染色以及Kim-1的RT-PCR来观察肾脏损伤坏死情况,免疫荧光、免疫组化来检测F4/80、LY6G、MPO的浸润以及HMGB1的表达量和分布情况,RT-PCT检测炎症因子 IL-6、TNF-α、IL-1β 以及趋化因子 CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL5、ICAM-1等的表达变化,Western blot检测胞浆HMGB1、TLR4以及胞核P65表达量的变化。结果与假手术组和单纯给予GSPE组相比,双侧I/R+PBS组小鼠手术后血肌酐、尿素氮明显增高,而双侧I/R+GSPE组小鼠其血肌酐、尿素氮只有轻度上升,尤其是在给予小鼠250mg/kg浓度的GSPE时其上升幅度最小。同时与双侧I/R+PBS组小鼠相比,双侧I/R+GSPE组小鼠其肾小管损伤坏死的程度大大减轻,Kim-1和Tunnel阳性细胞的表达量明显下降,间质炎症细胞—巨噬细胞(F4/80阳性细胞)和中性粒细胞(LY6G阳性细胞/MPO阳性细胞)浸润减少,炎性因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)和趋化因子(CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL5、ICAM-1)的表达也明显减少。在假手术组和单纯GSPE组,HMGB1主要表达在肾小管上皮细胞胞核上,极少有胞浆核转移,其下游受体--TLR4和效应蛋白--P65表达量极低,而在双侧I/R+PBS组HMGB1大量转移至胞浆并释放至胞外,并激活其下游TLR4和P65,这一信号通路的活化在双侧I/R+GSPE组被明显抑制。结论GSPE通过抑制HMGB1-TLR4-P65信号通路来减轻了急性肾损伤时的炎症爆发,从而缓解了肾小管的损伤。第二部分GSPE通过抑制肾间质炎症来减轻慢性肾纤维化目的探讨GSPE在慢性肾纤维化模型中所起的作用及其抗炎机制。方法将6周大小的C57BL/6雄性小鼠分为假手术组、单纯给予GSPE组、单侧I/R+PBS组、单侧I/R+250mg/kgGSPE组等4组。在37℃条件下,假手术组开腹30分钟,手术小鼠夹闭左侧肾脏30分钟,右侧肾脏不予处理,术后一天开始通过灌胃连续给予PBS和GSPE14天后,提取标本。PAS染色观察肾脏形态学变化,Masson和天狼星红染色观察纤维化程度,免疫组化和Western blot来检测PDGFR-β、Collagen I、Vimentin、α-SMA、HMGB1、胞浆TLR4以及胞核P65的表达变化,免疫荧光检测F4/80 和 LY6G 的表达及分布,RT-PCR 检测 CCL2、IL-6、TNF-α、IL-1β 的表达。结果假手术组和单纯给予GSPE组Masson和天狼猩红染色未见胶原沉积,PDGFR-β、Collagen I、Vimentin、α-SMA的表达量极少,但在单侧I/R+PBS组,纤维化指标都明显上升,而这一上升变化在单侧I/R+GSPE组均被明显抑制。与纤维化变化趋势一致的还有间质炎症反应,GSPE干预后明显减轻了炎症细胞--巨噬细胞(F4/80阳性细胞)和中性粒细胞(LY6G阳性细胞阳性细胞)的浸润以及炎症因子和趋化因子--CCL2、IL-6、TNF-α、IL-1β等的表达。与假手术组相比,单侧I/R+PBS组的HMGB1表达量升高,主要表达于肾间质,其下游TLR4和P65表达也相应增加,但这一变化在单侧I/R+GSPE组有所减轻,但不如急性肾损伤时明显。结论GSPE通过抑制HMGB1-TLR4-P65信号通路来减轻慢性肾纤维化进程中的间质炎症,从而减轻了肾间质纤维化。第三部分GSPE通过抑制成纤维细胞的活化来减轻肾纤维化目的通过体外实验研究GSPE对肾脏成纤维细胞活化的作用及其机制。方法用10ng/ml TGF-β刺激NRK-49F细胞,并给予3种不同浓度GSPE干预,48h后提取标本,Western blot、RT-PCR及细胞免疫荧光检测Fibronectin、Collagen I、α-SMA等纤维化指标的变化。同样用10ng/ml TGF-β刺激及GSPE干预细胞,于30分钟时提取蛋白,用 Western blot 检测 Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3、JNK、p-JNK等信号蛋白的表达。结果与 Control 相比,用 TGF-β 刺激 48h 后的 NRK-49F 细胞中 Fibronectin、Collagen I、α-SMA的表达量明显上升,但在给予GSPE干预后,这些纤维化蛋白表达降低,而且其降低程度与GSPE的浓度成正比。而于30分钟提取的蛋白,其Smad2/3、JNK的表达量并无变化,但p-Smad2、p-Smad3、p-JNK等磷酸化蛋白在TGF-β刺激后表达明显上升,但均可被GSPE抑制,且其抑制程度与GSPE浓度成正比。结论GSPE通过阻断Smad和JNK信号通路来抑制TGF-β诱导的成纤维细胞的活化。