铜是人体内必需的微量元素，正常人血浆铜浓度约为15 μM。微量的铜是细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶等必需的组成部分。 现大量研究工作已表明，环境或基因因素的变化可能会导致铜在体内平衡的破坏并最终导致各种神经退行性疾病(neurodegenerative disease)，如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、亨廷顿舞蹈病(Hungtington disease，HD)。而遗传性铜代谢异常更能引起严重的神经系统变性疾病--Menkes病和Wilson病。 Menkes病和Wilson病两者基因55％～60％具有同源性，临床表现亦十分相近。Menkes病由于ATP7A基因缺陷而导致体内经肠道吸收铜障碍，肝和脑组织内的铜含量降低，临床有智能减退和共济失调等神经系统变性表现，组织学上特别是小脑变化具有特征性，包括颗粒细胞层变薄、神经元细胞减少等。Wilson病则由于ATP7B基因缺陷导致胆道排铜减少，铜与组织中蛋白结合而沉积于神经系统中引起神经系统变性，组织学及电镜观察显示神经细胞变性坏死，在其毛细血管基底膜呵见高电子密度物质(铜颗粒)沉积等病理改变。 铜代谢异常的机理，迄今尚未完全阐明。Yan等发现低钾可诱导小脑颗粒神经元(Cerebellar Granule Neurons，CGNs)凋亡：去极化浓度的K+(培养液中含25 mmol/L的KCl)抑制体外培养CGNs的凋亡；而低钾(培养液中含5mmol/L的KCl)则诱导CGNs)凋亡，且其凋亡具有典型的形态学和生化特征：包括细胞核明显固缩、凝聚和断裂。该模型现已成为研究神经元凋亡及其信号转导机制的经典模型之一。研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinane，P13-K)及其下游激酶Akt-1与神经元存活密切相关，是神经元存活的重要通路。微量的铜是否干扰低钾诱导CGNs凋亡，以及通过什么机制影响CGNs的存活尚未见报道。另一方面，近期的研究也表明，铜的神经毒性作用可能与细胞的氧化应激有关。铜在神经元中与活性氧离子反应并诱导氧自由基的生成，造成细胞内自由基生成和清除能力失衡，后者进一步导致ATP合成减少、DNA损伤和神经元的凋亡。但其详细机制还不完全清楚。而细胞凋亡的发生发展与钙超载作用密切相关。钙作为凋亡的触发者，可能通过激活钙依赖的核酸内切酶或通过其他效应，调控信号的转导。细胞内Ca2+浓度升高是细胞损伤的重要原因，细胞内[Ca2+]i的变化可能是铜诱导神经元细胞凋亡/死亡的关键信号。 基于钙在凋亡中的重要作用，任何可抑制钙离子进入细胞的介入方式均可能有神经保护作用。尼莫地平作为L-型钙通道拮抗剂，可特异性地阻断神经细胞膜上的Ca2+通道，且对神经元的钙通道有特别高的亲和力，它可能对铜诱导神经元细胞凋亡/死亡有保护作用。 因此，我们设计本课题，在细胞水平上反映铜与神经系统退行性疾病的关系。研究目的: 1.利用低钾诱导cGNs凋亡模型，观察微量的铜对CGNs凋亡是否具有神经保护作用，探讨其量效及时效关系；并观察该作用与P13-K/Akt通路的关系。 2.建立铜诱导CGNs凋亡模型，研究铜与CGNs的凋亡量效及时效关系；观察多-种药物对铜诱导CGNs的凋亡是否有保护作用，并研究其作用的机制；观察尼莫地平对铜诱导CGNs凋亡是否具有保护作用，并进一步探讨其与ROSK[ca2+]i的信号转导机制。 研究方法: 1.SD大鼠乳鼠CGNs的分离和原代培养； 2.以神经元存活率(MTT法)、细胞形态学(相差、Hoechst333258染色、PI染色)、DNA凋亡梯带、流式细胞仪(FCM)观察DNA亚二倍体凋亡峰等为指标评价铜对CGNs的双向作用； 3.用蛋白免疫印迹法(WB)检测MAPK级联传导途径3个成员：pERK、pJNK和p38蛋白水平的变化来探讨铜对CGNs的凋亡的信号转导机制； 4.给予多种药物干预微量铜对CGNs的双向作用，并探讨其机制； 5.用激光共聚焦法检测DCFH荧光来评价铜对cGNs的损伤作用与Ros的关系； 6.用激光共聚焦法检测Fura荧光探讨铜对cGNs损伤与[Ca2+]i的关系； 7.用激光共聚焦荧光检测法等探讨尼莫地平抗铜对CGNs损伤的作用机制。 结果: 1.MTT结果显示，铜对CGNs有双向作用：一方面适量的铜可对低钾诱导CGNs神经元凋亡有保护作用，1～40 u mol/L的铜可抗低钾所致的大鼠CGNs凋亡，明显提高CGNs的存活率。铜的神经保护作用可以持续72 h以上。另一方面，铜可诱导CGNs凋亡，甚至坏死，其损伤具有时间和剂量依赖性。其中，铜50μM作用24 h最适合作为铜诱导的CGNs凋亡模型。 2.通过观察细胞形态学改变、Hoechst33258染色、PI染色、DNA凝胶电泳结果等进一步验证，20 μM的铜对低钟诱导CGNs神经元凋亡具保护作用，能够明显抑制低钾诱导的CGNs核固缩、碎裂；另一方面，铜诱导的CGNs凋亡具有时间和剂量依赖性，高剂量铜(大于50 μM)更多的是导致CGNs坏死。 3.FCM检测亚二倍体峰结果显示，铜(20 μM)对低钾诱导CGNs凋亡具有保护作用。 4.WB结果显示，铜50 μM作用CGNs1～12 h内，p-ERK的表达逐渐加强达峰值后转弱，以6 h表达最强；p38也在是1～12 h内表达逐渐加强达峰值后转弱，以3h表达最强；而p-JNK在铜501xM作用CGNs1-12h内无明显的变化。因此，铜对CGNs的毒性作用可能激活MAPKOp的ERK及P38通路，但可能与JNK通路无关。 5.激光共聚焦荧光检测法结果显示，铜对CGNs的毒性作用可能与RoS及[Ca2+]i的激活有关。 6.MTT结果显示，磷脂酰肌醇3-激酶(P13-K)抑制剂LY294002可阻断铜的保护作用。 7.MTT结果显示各种药物对细胞生存率的作用：(1)微管蛋白聚合剂(Taxol)对铜诱CGNs凋亡无保护作用； (2) 影响Na-K泵的锂离子对铜诱导CGNs凋亡无保护作用； (3) JNK通路上游激酶阻断药CEP．1347对铜诱导cGNs凋亡无保护作用； (4)JNK抑制剂sP600125对铜诱导CGNs凋亡也无保护作用； (5)N．甲基．D．天(门)冬氨酸(NMDA)拮抗剂MK801对铜诱导CGNs凋亡无保护作用；(6)尼莫地平对铜诱导CGNs凋亡有很强的保护作用。(7)P38通路阻断药SB203580~铜诱导CGNs~有保护作用； (8)MAPK通路阻断药PD98059对铜诱导CGNs凋亡有保护作用；(9)sB203580与PD98059合用对铜诱~CGNs凋亡也有保护作用;(10)非特异性钙拮抗剂稀土元素镧对铜诱导cGNs凋亡有保护作用。 小结: 1.首次发现，铜对cGNs具有双向作用，低浓度的铜对低钾诱导CGNsN凋亡有保护用，其保护作用在一定的浓度范围内是长时效的，P13-K/Akt信号传导通路可能参与其保护作用；高浓度的铜可诱导CGNs凋亡或坏死，且具剂量和时间依赖性。 2.铜对CGNs的毒性作用可能激活MAPK中的ERK及P38通路，但可能与JNK通路无关。 3.铜对CGNs的毒性作用可能与ROS的产生及钙通道的激活有关。 4.尼莫地平能较好地阻断铜对CGNs的毒性作用，提示尼莫地平可能有助于神经退行性疾病的治疗。