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柯萨奇病毒(coxsackievirus)属于小RNA病毒科(Picornaviridae),肠道病毒属(Enterovirus)的病毒。柯萨奇病毒无包膜,衣壳呈二十面体对称结构。柯萨奇病毒基因为约7.5 kd的单股正链RNA,基因具有5’非编码区、一个开放阅读框(open reading frame,ORF)和3’非编码区。病毒的开放阅读框编码1条多肽链,随后该多肽链被病毒编码的蛋白酶切割为11个蛋白。根据病毒对乳鼠的致病特性,柯萨奇病毒分为A和B两类。其中B类病毒存在6个血清型。在B类病毒的6个血清型中,B1,B2和B3具有显著的心脏嗜性。柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)是人类病毒性心肌炎的常见病原,并且病毒性心肌炎经常导致扩张型心肌病和心脏衰竭的发生。内质网(endoplasmicreticulum,ER)是真核生物细胞器,内质网参与蛋白折叠、钙离子储存和脂类合成等,具有重要的生理功能。当细胞内或细胞外的环境发生改变,例如病原入侵、葡萄糖缺乏或钙离子失衡等情况下,内质网功能紊乱,并且大量的非折叠或者错误折叠的蛋白积累在内质网。此时细胞会产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER),并激活非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR是细胞的保护性反应,它促使内质网和细胞恢复正常的生理状态。当内质网应激过于激烈或者持续时间太长,机体通过内质网应激诱导凋亡,清除受损细胞。自噬(Autophagy)是一种高度保守的溶酶体降解机制。生物体存在3种形式的自噬,即小自噬(microautophagy)、伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和大自噬(macroautophagy)。在这3种自噬中,关于大自噬的研究最为透彻,论文中所提及的“自噬”即大自噬。自噬的发生包括3个步骤:具有双层膜结构的自噬体形成并包裹细胞质成分;自噬体与核内体融合;随后与溶酶体融合降解内容物。目前已经鉴定了 30多种调控自噬的蛋白(Autophagy related gene,ATG),而且多种自噬相关蛋白在酵母和哺乳动物中高度保守。内质网应激和自噬是细胞两种不同的生物学反应机制,越来越多的研究表明内质网应激能够引起自噬。内质网处于应激状态时,自噬能够降解错误折叠蛋白缓解内质网应激,促使内质网恢复稳态。在病毒感染过程中,一些病毒能够引起内质网应激和自噬。本文以引起病毒性心肌炎的CVB3病毒为研究对象,探索CVB3病毒感染引起的内质网应激与自噬的关系。在本研究中我们分别检测CVB3病毒感染HeLa细胞的内质网应激和自噬水平。为了鉴定CVB3病毒感染是否引起内质网应激,我们使用CVB3病毒(感染复数(multiplicity,MOI)为10)感染HeLa细胞,并在病毒接种后的6 h,8 h和10 h时收集细胞。通过Western Blot方法检测内质网应激标志蛋白GRP78的表达水平。结果显示CVB3病毒感染引起HeLa细胞中的GRP78蛋白表达增加,提示CVB3病毒感染HeLa细胞可引起内质网应激。随后,使用Western Blot和逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测CVB3病毒感染HeLa细胞中非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的3条信号通路PERK-eIF2α,IRE1-XBP1和ATF6的激活情况。结果显示CVB3病毒感染HeLa细胞引起PERK和eIF2α的磷酸化水平增加;IRE1的磷酸化水平增加,并且引起XBP1 mRNA的特异性切割;同时ATF6蛋白发生切割。以上结果提示CVB3病毒感染HeLa细胞引起内质网应激并且激活了PERK-eIF2ct,IRE1-XBP1 和ATF6信号通路。为了鉴定CVB3病毒感染HeLa细胞是否引起自噬。分别使用Western Blot和激光共聚焦方法检测CVB3病毒感染HeLa细胞中LC3蛋白的表达、定位和p62蛋白的表达水平,结果显示CVB3病毒感染促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达比值升高和定位于自噬体的LC3蛋白增多,同时降低p62蛋白的表达。随后检测CVB3病毒感染HeLa细胞中的调控自噬蛋白ULK1、AMPK和mTOR的激活情况,结果显示CVB3病毒感染分别促使ULK1和AMPK的磷酸化水平增加,同时降低mTOR和磷酸化mTOR蛋白的表达水平。这表明CVB3病毒感染分别激活ULK1和AMPK活性、同时抑制mTOR活性,进而促进自噬的发生。为了全面了解CVB3病毒感染细胞中自噬相关基因转录水平的变化,我们使用荧光定量RT-PCR检测CVB3病毒感染细胞中的19个自噬相关基因mRNA转录水平。结果显示CVB3病毒感染引起ATG5,ATG10,ATG12,FIP200,GABARAPL1 和GABARAPL2基因mRNA的转录水平增加,而且随着感染时间的延长,上述基因转录水平逐渐上调,结果表明CVB3病毒感染诱导自噬相关基因差异性表达,从而促进自噬的产生。为了了解自噬与CVB3病毒复制之间的关系,分别将自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)和溶酶体抑制剂阿洛司他丁(Aloxistatin,E46D)处理CVB3病毒感染的HeLa细胞,通过Western Blot检测(CVB3病毒结构蛋白VP1蛋白的表达。结果显示,与CVB3病毒感染细胞相比,雷帕霉素和E64D促使CVB3病毒VP1蛋白表达,而3MA降低VP1蛋白的表达。结果提示CVB3病毒感染诱导自噬进而促进病毒复制。内质网应激是自噬的引发原因之一。为了鉴定CVB3病毒感染诱导的内质网应激是否调控自噬的发生,我们使用PERK抑制剂GSK2656157、ATF6抑制剂AEBSF和IRE1抑制剂STF-083010,分别作用CVB3病毒接种的HeLa细胞,随后检测细胞的自噬水平。结果显示,与CVB3病毒感染细胞相比,GSK2656157、AEBSF或STF-083010处理均能降低病毒感染细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达比值。这表明在CVB3病毒感染分别通过PERK、ATF6和IRE1信号通路调控自噬的发生。随后我们进一步探索在CVB3病毒感染细胞中内质网应激是否调控自噬相关基因的转录。使用荧光定量PCR检测GSK2656157、AEBSF或STF-083010处理的CVB3病毒感染细胞中的ATG5,ATG10,ATG12,FIP200,GABARAPL1 和GABARAPL2基因mRNA转录水平。结果显示,与CVB3病毒感染细胞相比,ATF6抑制剂处理下调ATG5和ATG10的转录水平;IRE1抑制剂能够下调ATG5,ATG12,GABARAPL1和GABARAPL2的转录;PERK抑制剂处理细胞中上述自噬相关基因的转录水平无明显变化。提示在CVB3病毒感染细胞中内质网应激的3条信号通路调控自噬的机制各不相同。总之,本研究证实CVB3病毒感染HeLa细胞诱导内质网应激,并通过内质网应激调节自噬的发生,进而促进病毒的复制。