背景:龋病发病率高,覆盖范围广,是全球最普遍的健康问题。牙菌斑微生态菌群失衡是龋病发生发展的关键因素,白色念珠菌和变异链球菌作为口腔常见共生菌,也是条件致龋菌,两者之间的协同关系在牙菌斑生物膜的成熟和龋病的进展中发挥重要作用。V型质子泵（V-ATPase）位于白色念珠菌液泡膜,主要负责离子转运和p H稳态,是白色念珠菌适应外界环境压力、调控菌丝生成和生物膜形成的重要蛋白,有望成为抗白色念珠菌-变异链球菌生物膜和龋病早期防治的潜在靶点,但目前尚缺乏V-ATPase调控白色念珠菌-变异链球菌共生生物膜致龋性的相关研究。目的:通过不同患龋情况儿童口腔中白色念珠菌的检出和基因表达、V-ATPase抑制剂处理和V-ATPase基因敲除,阐明V-ATPase对白色念珠菌-变异链球菌生物膜致龋性的调控作用及其机制,为龋病早期生态防治提供理论依据和实验基础。方法:1.从患龋儿童和无龋儿童牙菌斑中分离培养白色念珠菌,比较检出率差异,q RT-PCR检测白色念珠菌临床分离株V-ATPase相关基因表达水平,筛选可能与白色念珠菌致龋毒力相关的V-ATPase亚基及其编码基因。2.白色念珠菌野生型SC5314经不同浓度V-ATPase特异性抑制剂bafilomycin A1（BAF）处理后,通过监测生长曲线和菌液p H值观察生长和产酸情况,结晶紫染色法测定生物膜总量,q RT-PCR检测生物膜形成相关基因表达量。将白色念珠菌与变异链球菌标准株UA159共培养构建双菌种生物膜,测定生物膜总量,乳酸检测试剂盒测定乳酸产量,激光共聚焦显微镜（CLSM）和扫描电镜（SEM）分别观察生物膜三维结构和表面形貌。3.结合白色念珠菌临床株V-ATPase相关基因表达量的检测结果,选择在龋病中高表达的VMA3、VMA4、VMA11,利用融合PCR技术和同源重组原理构建基因敲除株,观察白色念珠菌SC5314和敲除株的生长情况、菌落和细胞形态。将白色念珠菌各菌株与变异链球菌UA159共培养,观测共生生物膜的生物膜量、乳酸产量和形貌结构,蒽酮法测定胞外多糖含量,q RT-PCR测定变异链球菌致龋毒力相关基因表达量,转录组测序结合生物信息学手段分析白色念珠菌的差异基因表达和功能调控通路富集水平。4.将变异链球菌UA159及其与白色念珠菌SC5314和VMA3、VMA4、VMA11基因敲除株的混合菌液接种于SD大鼠磨牙区域,构建龋病研究体内模型。Keyes评分法评价大鼠磨牙患龋情况,CLSM和SEM观察牙菌斑生物膜形貌结构。结果:1.从59名龋病儿童和50名无龋儿童的牙菌斑样本中,共检出17株白色念珠菌（龋病组13株,无龋组4株）,龋病组检出率（22.03%）显著高于无龋组（8.00%）（P＜0.05）。V-ATPase编码基因VMA3、VMA4、VMA8、VMA11、VMA13在龋病组的表达水平较高（P＜0.05）。2.与阴性对照组相比,0.1μM BAF对白色念珠菌的生长、产酸和生物膜总量未见显著影响,0.5μM BAF处理后白色念珠菌的生长速率减慢,菌液p H值下降变缓,生物膜量显著降低（P＜0.001）。白色念珠菌黏附和菌丝形成相关基因ALS1、ALS3、ALS5、EFG1、UME6的表达在0.1μM BAF处理后即出现大幅下调,0.5μM BAF处理后下调趋势更明显（P＜0.05）。抑制剂BAF可使白色念珠菌-变异链球菌共生生物膜中微生物数量和胞外多糖含量显著减少（P＜0.01）,白色念珠菌未能通过菌丝的大量生长构建网状支架结构,生物膜厚度减小,结构疏松。BAF浓度达0.5μM时共生生物膜总量和乳酸产量显著降低（P＜0.05）。3.VMA3、VMA4、VMA11基因敲除后其他V-ATPase相关基因的表达量也显著下调（P＜0.05）。与白色念珠菌SC5314相比,VMA3、VMA4、VMA11敲除株生长速率减慢,菌丝生长受抑制,对碱性环境的耐受能力减弱,部分细胞发生细胞壁完整性破坏。VMA3、VMA4、VMA11基因敲除株形成单菌种生物膜和与变异链球菌形成共生生物膜的能力均减弱（P＜0.001）。共生生物膜中两种菌的数量和胞外多糖含量显著降低,生物膜厚度减小,生物膜结构疏松,水溶性葡聚糖（WSG）含量在VMA3和VMA4敲除后显著降低,水不溶性葡聚糖（WIG）含量在三个基因敲除组中均显著降低（P＜0.001）,乳酸产量未见减少。共生生物膜中变异链球菌胞外多糖合成相关基因gtf B、gtf C、gtf D和黏附相关基因gbp B、gbp C的表达量未见减少,但胞外多糖分解相关基因dex A和dex B表达量显著大幅上调（P＜0.01）。VMA3、VMA4、VMA11敲除株与变异链球菌形成共生生物膜后,与SC5314对照组相比,分别检测到差异表达基因1339、1199、548个。经GO基因功能注释与富集分析,显著上调的基因主要参与细胞膜的组成和完整性,显著下调的基因主要参与金属离子稳态、酮酸以及各种小分子和有机酸的合成与代谢。经KEGG通路注释与富集分析,显著上调的基因主要参与细胞减数分裂,显著下调的基因主要参与丙酮酸和氨基酸的代谢、核糖体、辅因子合成等通路。4.变异链球菌UA159单独定植及其与VMA3、VMA4、VMA11敲除株混合定植组大鼠龋损情况相似,光滑面龋和窝沟龋的数量和严重程度、牙菌斑的覆盖范围和厚度、牙菌斑生物膜中微生物和胞外多糖的含量均显著高于空白对照组和阴性对照组,显著低于变异链球菌UA159-白色念珠菌SC5314阳性对照组（P＜0.05）。结论:1.白色念珠菌的检出与儿童龋病的发生密切相关,V-ATPase相关基因VMA3、VMA4、VMA8、VMA11、VMA13可能参与调控白色念珠菌致龋毒力。2.V-ATPase可通过参与白色念珠菌多种物质代谢和金属离子稳态相关通路,调控其生存、毒力及其与变链的相互作用,同时参与调控共生生物膜中变异链球菌的胞外多糖代谢,从而影响共生生物膜的生物膜量、胞外多糖含量、生物膜结构等致龋毒力因素。3.V-ATPase参与调控白色念珠菌-变异链球菌共生生物膜的体内致龋性,有望成为龋病早期防治的潜在靶点。