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早在上个世纪50年代,Austin和Chang就各自发现,生殖道内的迁移过程对哺乳动物成熟精子获得最终使卵子受精的能力至关重要,这种现象也被Austin形象地命名为获能。时至今日,随着对获能过程中精子生理功能调控机制研究的不断深入,胞内自由钙离子([Ca2+]i)作为细胞内最重要的第二信使之一,被证实在超活化运动、顶体反应、穿透卵子能力等精子关键功能的调节过程中发挥着不可替代的作用。在许多物种中,精子特异性阳离子通道 CatSper(cationchannel of sperm)介导的胞外 Ca2+内流是[Ca2+]i升高的主要途径。哺乳动物CatSper通道复合体由四个成孔亚基(CatSper 1,2,3,4)以及至少六个辅助亚基(CatSper β,γ,δ,ε,ζ,以及Efcab9)共同组成,任一亚基的功能缺陷都将直接导致雄性生育力减低,甚至完全不育。在生理条件下,CatSper本质上主要受细胞内pH(pHi)、细胞膜电位(Em)控制。除此之外,人精子CatSper还可受生殖道内多种类固醇、前列腺素类生理激素共同调节。因此,在获能过程中,人精子CatSper发挥着化学感受器的作用,通过将胞外微环境中复杂的化学信号转化为胞内Ca2+信号,以保障受精过程的顺利实现。然而,目前有关CatSper的具体调控机制在很大程度上仍是个未知数。与CatSper介导的Ca2+信号相辅相成,胞内cAMP是调节精子获能的另一个重要因素。在哺乳动物精子内,胞内cAMP含量主要受其合成酶——可溶性腺苷酸环化酶(sAC),及其降解酶——磷酸二酯酶(PDEs)共同控制。精子在生殖道内一旦遇到高浓度的HCO3-后,便可迅速激活sAC活性以提高胞内cAMP浓度,从而启动cAMP及其下游蛋白激酶A(PKA)、鸟苷酸转化因子(EPAC)等信号通路。与此同时,PDEs对cAMP的降解作用则可以避免cAMP浓度过度升高,并在合适的时候终止cAMP信号。cAMP信号通路的激活将导致精子重要蛋白发生磷酸化及其他功能改变,这也被视作精子获能与否的重要指标。尽管cAMP信号和CatSper介导的Ca2+信号对精子功能的重要性毋庸置疑,但他们之间的内在联系却饱受争议,尤其是在CatSper是否受胞内cAMP信号控制这一关键问题上。目前,越来越多的证据表明,cAMP透膜性类似物,8-Bromo-cAMP,不仅可以有效模拟精子胞内cAMP功能,还能激活人和小鼠CatSper,从而导致精子[Ca2+]i升高。从表面上来看,这一事实似乎更支持CatSper受cAMP信号控制这一观点。然而,来自不同团队的大量研究结果却显示,无论是利用HCO3-促进cAMP合成还是通过PDEs抑制剂抑制cAMP降解,甚至是在sAC转基因小鼠中利用光遗传手段人为地控制精子cAMP含量,都无法影响CatSper活性和[Ca2+]i。此外,CatSper的激活过程也不伴随胞内cAMP含量的增加。这些证据都暗示着,CatSper并不受cAMP信号控制。但是,争议到此并没有解决,我们仍然注意到有少量研究却指出,HCO3-可以引起人和小鼠精子[Ca2+]i增加。尤其在小鼠精子中,8-Bromo-cAMP和HCO3-诱导的[Ca2+]i可被PKA抑制剂所阻断。根据这些新颖的发现,CatSper受cAMP/PKA信号控制这一曾经看似可信的观点又被重新提出,至少是在小鼠精子中。由此可见,有关CatSper通道与细胞内cAMP信号的功能联系目前仍未有一个清晰的定论。此外,在研究人精子CatSper是否还受其他信号通路调控时,一种由G蛋白耦联受体CCR6介导的信号通路吸引了我们的兴趣。CCR6最初发现于免疫细胞,可通过与免疫因子,如巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP-3α/CCL20)以及多种具有抑菌活性的β防御素(DEFB1/2)结合后,启动免疫应答反应。最新研究表明,CCR6同样表达于哺乳动物成熟精子中,而生殖道内也确定存在多种CCR6的配体物质。其中,由生殖道上皮细胞分泌的人β防御素1(DEFB1),现已被证明可以通过CCR6结合于人精子表面,不仅可以改善精子抗菌活性,而且还能促使精子[Ca2+]i增加,从而在精子运动能力调节过程中发挥重要作用。考虑到CatSper与[Ca2+]i的密切关系,我们猜测DEFB1/CCR6信号通路很有可能是潜在的CatSper调控因素。本研究中,为了深入阐明CatSper与细胞内cAMP信号以及DEFB1/CCR6的关系,我们在健康男性捐献者的精子以及由CATSPER2基因缺失导致的不育患者精子中,主要利用精子全细胞膜片钳技术、离子(Ca2+、H+)敏感荧光测定等技术,系统地研究了 HCO3-、cAMP及其多种透膜性类似物、多种cAMP效应分子(PKA、EPAC)抑制剂对人精子CatSper功能及[Ca2+]i的影响。另一方面,作为合作课题,我们还与香港中文大学陈小章教授团队一起,共同研究了 DEFB1/CCR6复合物对人精子CatSper的潜在激活作用。我们的研究结果显示,人精子CatSper并不受胞内cAMP和(或)PKA信号控制。但cAMP及其透膜性类似物在极高的非生理浓度下,可以通过细胞外环核苷酸结合位点激活CatSper。此外,我们还发现,常用的PKA抑制剂、EPAC抑制剂等药理学工具虽然可以影响CatSper活性,但这些效应的产生并不依赖于胞内信号途径。因此,我们推论,CatSper受cAMP信号控制这一结论,主要是基于干扰cAMP信号药理学工具的非特定效应做出的不准确判断。与此同时,我们还发现,同类固醇、前列腺素等生理激素类似,生殖到内存在的DEFB1也可以激活人精子CatSper。这一激活效应的实现依赖于精子膜表面的趋化因子受体CCR6。总的来说,我们的研究解决了本领域内存在的诸多争议性问题,为将来CatSper生理调控机制的进一步研究做出了重要的铺垫。