[目的]　　 探讨在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞中，高危型人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16 E6和E7癌蛋白激活的信号通路对低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-8(Interleukins-8，IL-8)蛋白表达以及体外血管生成的影响，并进一步阐明E6或E7癌蛋白诱导HIF-1α蛋白过表达的机制。　　 [方法]　　 1.稳定表达HPV16 E6或E7蛋白细胞系的建立:用脂质体将EGFP质粒空载体和携带有HPV16 E6和E7及其突变体基因的质粒(E6、 E7、 E6m和E7m)分别转入A549和NCI-H460细胞。瞬时转染后，G418结合流式细胞仪分选稳定转染细胞株。用PCR扩增细胞目的基因，用Western blotting检测目的蛋白表达情况。　　 2.HIF-1α蛋白过表达模型验证:Western blotting检测各组稳定转染细胞中HIF-1α蛋白表达水平。　　 3.E6和E7癌蛋白对体内血管生成影响的验证:用基质胶在裸鼠皮下建立体内血管生成模型，10天后观察血管生成情况，并用于免疫组化测定基质胶中VEGF、 HIF-1α和CD31蛋白的表达水平。　　 4.E6和E7癌蛋白对VEGF基因启动子活性的影响:用双荧光素酶法检测各组细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光强度，计算并比较各组细胞中VEGF基因启动子活性。　　 5.E6和E7癌蛋白对PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信号通路的影响:用基因芯片检测E6或E7癌蛋白对NSCLC细胞中磷酸化蛋白的影响。用Westernblotting验证PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信号通路中相关蛋白的表达水平。　　 6.PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信号通路对HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白表达及微管形成的影响:用抑制剂分别抑制p-Akt、p-ERK1/2和p-c-Jun蛋白表达，Western blotting分析p-Akt、p-ERK1/2和p-c-Jun蛋白抑制后HIF-1α蛋白表达情况;ELISA分析条件培养液中VEGF和IL-8蛋白表达情况，实时定量PCR分析各组细胞中VEGF和IL-8 mRNA表达情况;体外血管生成试剂盒检测各组细胞条件培养液对微管形成的影响。　　 7.E6和E7癌蛋白对HIF-1α蛋白稳定性和泛素化水平的影响:用放线菌酮(cycloheximide，CHX)和MG132分别抑制各组细胞（稳定表达HPV16 E6或E7、突变体、空载体的肺癌细胞）中HIF-1α蛋白的合成和降解，采用Western blotting分析HIF-1α蛋白表达水平和泛素化水平。　　 8.c-Jun蛋白对HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白表达和微管形成的影响:用si-RNA沉默c-Jun基因，Western blotting分析c-Jun蛋白被抑制后HIF-1α蛋白的表达水平、HIF-1α稳定性和泛素化水平。ELISA分析条件培养液中VEGF和IL-8的表达水平，用体外血管生成实验检测微管形成情况。　　 9.E6和E7癌蛋白对c-Jun和HIF-1α蛋白相互作用的影响:免疫共沉淀技术检测各组细胞中c-Jun和HIF-1α蛋白二聚体含量，并用免疫荧光技术定位c-Jun和HIF-1α在细胞中的相互作用位置。　　 [结果]　　 1.PCR及Western blotting结果显示，分别成功建立E6、E7癌蛋白稳定转染细胞系，且稳定表达E6、E7癌蛋白的细胞中HIF-1α蛋白表达水平明显高于对照组;体内血管生成实验表明E6和E7癌蛋白能明显促进血管形成和Matrigel组织中HIF-1α、VEGF和CD31蛋白的表达;双荧光素酶实验结果显示稳定表达E6癌蛋白的细胞中VEGF启动子的活性显著高于对照组（P＜0.01），但E7癌蛋白促进VEGF启动子活性的作用不明显。　　 2.蛋白质芯片结果显示稳定表达E6癌蛋白的细胞中有16种蛋白磷酸化水平改变，在稳定表达E7的细胞中有20种蛋白磷酸化水平改变。Western blotting验证结果表明:E6和E7癌蛋白明显激活PI3K/Akt/mTOR/P70S6K信号通路，但对ERK1/2信号通路的影响不明显;E7癌蛋白明显激活JNK/c-Jun信号通路，但E6癌蛋白对JNK/c-Jun信号通路影响不明显。　　 3.Western blotting结果显示:E6和E7癌蛋白促进HIF-1α的表达具有PI3K/Akt依赖性;在A549细胞中E6癌蛋白促进HIF-1α蛋白的表达具有ERK1/2依赖性，E7癌蛋白促进HIF-1α的表达不依赖于ERK1/2信号通路;在NCI-H460细胞中E6和E7癌蛋白促进HIF-1α蛋白的表达均不受ERK1/2信号通路调控;ELISA和实时定量PCR检测VEGF和IL-8的表达水平得到与HIF-1α一致的结果。体外血管形成实验也得到与HIF-1α一致的结果。　　 4.E6和E7癌蛋白能增强HIF-1α的稳定性，降低其泛素化水平，但对VHL蛋白表达没有明显影响。HIF-1α蛋白的表达依赖于c-Jun蛋白表达而不依赖于p-c-Jun; c-Jun蛋白被抑制后HIF-1α稳定性下降，泛素化水平升高。同样VEGF和IL-8蛋白表达水平及微管形成能力均下降。免疫共沉淀结果显示E6和E7癌蛋白能促进HIF-1α-c-Jun蛋白二聚体的形成。免疫荧光结果显示HIF-1α-c-Jun二聚体在在细胞核中形成。　　 [结论]　　 稳定表达的E6和E7癌蛋白能促进非小细胞肺癌血管生成，且E6和E7癌蛋白促进HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白过表达主要受PI3 K/Akt/mTOR/P70S6K信号通路调控。另外，E6和E7癌蛋白可以通过增强c-Jun与HIF-1α的相互作用，增强HIF-1α的稳定性，抑制HIF-1α泛素化降解，促使HIF-1α蛋白在细胞中堆积。因此，通过抑制c-Jun蛋白和PI3K/Akt信号通路进而抑制HIF-1α蛋白的表达可能将成为HPV相关肺癌防治的有效策略。