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一、AS患者与脊柱损伤患者的韧带组织在成骨矿化程度和ANKH基因含量间的比较[目的]比较AS实验组与JK对照组韧带组织间的成骨矿化差异。探讨ANKH是否参与了AS异位骨化的形成。[方法]分别取AS韧带做实验组,脊柱损伤患者的韧带组织做正常对照组,利用HE染色、茜素红染色和冯库萨染色观察各组织的大体形态和矿化程度。同时行免疫组织化学技术对ANKH的表达进行定位分析,以及行RT-PCR技术检测两组织间ANKH表达是否存在差异。[结果]两种组织HE染色均可见含有较大量的成纤维细胞,且细胞形态未见明显差异。茜素红染色和冯库萨染色结果显示AS关节韧带附着端有明显的矿化,而正常人未见矿化。免疫组化检测发现ANKH主要定位在细胞膜,且其在韧带成纤维细胞中有较高表达。RT-PCR检测发现：ANKH基因在AS实验组与JK对照组间有明显差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]AS患者韧带异位骨化起始于关节韧带附着点处,且韧带骨化组织间存在较大量的成纤维细胞。AS患者的韧带组织中ANKH表达较少,ANKH基因可能在AS患者韧带组织的异位成骨过程中起到重要作用。二、原代成纤维细胞的培养及两种组织的成纤维细胞间成骨矿化能力和ANKH基因含量的比较[目的]掌握简单高效的原代培养成纤维细胞的方法。比较两组成纤维细胞间的成骨矿化能力,研究ANKH基因是否参与了AS异位骨化的形成及其可能的参与机制。[方法]两组韧带组织的原代成纤维细胞均采用组织块贴壁法培养获得,并镜下观察两组原代细胞的形态。取第三代细胞行免疫荧光技术鉴定成纤维细胞的含量。分别取两组的第三代成纤维细胞进行矿化诱导培养,并通过检测ALP活力变化及茜素红染色来对比两组成纤维细胞成骨分化、矿化能力的大小。同时行RT-PCR检测两组韧带成纤维细胞间ANKH表达是否存在差异。[结果]通过组织块贴壁培养法成功培养出韧带成纤维细胞,镜下观察细胞形态未见差异,经波形蛋白免疫荧光鉴定成纤维细胞含量在99%以上。碱性磷酸酶(ALP)活性检测及茜素红染色结果均显示,两组细的胞外ALP分泌均增加,并形成一定数量的矿化小结节,但AS实验组的胞外ALP分泌量及矿化小结节数量均较JK对照组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现,AS患者韧带成纤维细胞ANKH基因表达明显少于JK对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]组织块贴壁培养法可以简单高效的培养出高纯度的韧带成纤维细胞,韧带成纤维细胞具有成骨潜能,可经诱导分化为成骨细胞,从而发挥成骨矿化功能。体外培养条件下,AS患者韧带成纤维细胞的成骨趋势强于正常对照组,即成骨矿化能力更强,表明AS患者异位骨化与成纤维细胞的成骨分化存在某种关联。AS患者成纤维细胞的ANKH表达明显低于正常对照组,表明其可能参与了AS患者韧带组织的异位骨化形成,但其具体机制仍需要进一步研究。