二苯甲酮衍生物和五环三萜化合物生物合成基因的克隆与功能分析　　 从元宝草(HypericumsampsoniiHance)中克隆了2个类型Ⅲ聚酮合酶基因——二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因，对它们的生物学功能、器官及组织表达特性进行了分析，主要结果如下:　　 1)元宝草中二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因的克隆与功能分析:利用同源克隆的方法从元宝草中克隆到二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因，通过原核表达对其功能进行了分析，结果表明，重组HsBPS的最适底物是苯甲酰辅酶A，在体外酶促反应中，该酶催化1分子的苯甲酰辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A缩合生成2，4，6-三羟基二苯甲酮，同时产生少量副产物6-phenyl-4-hydroxy-2-pyrone;重组HsCHS的最适底物是p-香豆酰辅酶A，在体外酶促反应中，它催化1分子p-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A缩合生成柚皮素查尔酮，未检测到副产物。　　 2)HsBPS和HsCHS的器官特异性表达研究:分别采用定量PCR(QPCR)和蛋白免疫印迹杂交(westernblot)技术，从转录水平和翻译水平对不同生长时期（营养生长期和生殖生长期）元宝草植株中HsBPS和HsCHS的器官表达特性进行了研究。结果表明，这两个基因的表达特性具有较明显的差异。在营养生长期，HsBPS在根中的表达量是HsCHS的100多倍。在叶片中，HsBPS在相对较老的叶片中含量较高，而HsCHS在最嫩的叶片中表达量最高。在生殖生长期，HsBPS在根中的表达量与营养生长期相当，然而，HsCHS在该阶段的根中的表达量大幅度增加，与HsBPS的表达量达到同一水平。在花中，HsCHS的表达量最高，相当于HsBPS表达量的5倍。在果实中的情况则正好相反，HsBPS的表达量是HsCHS的10倍左右。　　 3)HsBPS和HsCHS的组织特异性表达研究:免疫组织化学研究结果表明，HsBPS主要在分布于元宝草根、茎、叶、花瓣和雄蕊的分泌囊和分泌道中表达，而HsCHS在元宝草的叶片和花的分泌细胞团中表达。说明分别由HsBPS和HsCHS参与催化的两条次生代谢途径在空间上是独立的。　　 从长春花(Catharanthusroseus(L.)G.Don)中克隆了2个五环三萜合成途径中的关键酶基因——香树脂醇合酶(CrAS)基因和香树脂醇氧化酶(CrAO)基因，对它们的生物学功能、器官表达特性和相关产物的积累模式进行了分析，主要结果如下:　　 1)长春花中香树脂醇合酶(CrAS)基因的克隆与功能分析:从长春花表皮细胞EST文库中，克隆了一个香树脂醇合酶(CrAS)基因。通过酿酒酵母表达系统对其功能进行了分析，结果表明CrAS是一个多功能的氧化鲨烯环化酶(OSC)，能够同时生成α-amyrin和β-amyrin，两者的比例为2.5∶1。　　 2)长春花中香树脂醇氧化酶(CrAO)基因的克隆与功能分析:通过筛选长春花表皮细胞EST文库，从6个功能未知的EST序列（CrContig3，CrContig4，CrContig5，CrContig8，CrContig9和CrContig10）中克隆到3个香树脂醇氧化酶的候选基因（CYP716AL1，CYP71D1V1和CYP71D1V2）。通过酿酒酵母表达系统分别对其功能进行了功能分析，体外实验结果表明，CYP716AL1是一个多功能的香树脂醇C-28氧化酶(CrAO)，在体外酶促反应中能够分别以α-amyrin，β-amyrin和lupeol为底物，催化C-28位的连续三步氧化反应，最终分别生成熊果酸，齐墩果酸和白桦脂酸。酵母体内试验进一步表明:同时导入了CrAO和CrAS的酿酒酵母能够同时生成熊果酸和齐墩果酸，二者的比率为2.2∶1。而同时导入了CrAO和拟南芥中的AtLUP1的酿酒酵母能够生成白桦脂酸。　　 3)CrAS和CrAO是长春花中五环三萜合成途径中的两个关键酶:QPCR结果表明，CrAS和CrAO主要在长春花的地上部分表达，其中叶片中表达量最高，而地下部分基本没有表达，这与熊果酸和齐墩果酸在长春花中的积累情况基本一致（熊果酸和齐墩果酸主要在长春花的地上部分积累，其中叶片中含量最高，地下部分含量极低）。另一方面，共表达CrAS和CrAO的酿酒酵母中产生熊果酸和齐墩果酸的比例为2.2∶1，与长春花各部位中熊果酸和齐墩果酸的比值(3∶1)接近。因此，酶学特性和基因表达特性同时表明CrAS和CrAO参与了长春花中的五环三萜合成途径，是其中的两个关键酶基因。