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肝细胞癌是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤,致死率在世界所有癌症中排名第四。尽管在肝癌诊断和治疗方面取得了一些进展,但全球发病率和死亡率仍呈上升趋势,因此亟需找到肝癌发病机制及遏制肿瘤生长的新疗法。肿瘤干细胞是肿瘤中的一个独特群体,具有自我更新、分化潜能。肿瘤干细胞的存在增强了肿瘤的异质性,此外肿瘤干细胞能够重塑肿瘤微环境,使肿瘤发生转移、耐药,从而抵抗临床治疗。因此破译肿瘤干细胞发挥促瘤作用的分子机制,是推进抗肿瘤治疗的重要基础。肿瘤干细胞和肿瘤微环境中免疫细胞相互作用,协同促进肿瘤逃避免疫监视。在非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等恶性肿瘤中,研究报道肿瘤干细胞与CD8+T细胞具有相关性,肿瘤干细胞通过直接或间接的作用调控CD8+T细胞的功能,但在肝癌中肿瘤干细胞与CD8+T细胞之间的关联尚不明确。多能转录因子Nanog在多种肿瘤中发挥肿瘤干细胞干性维持的重要作用,课题组前期研究发现Nanog可调控肝癌干细胞的自我更新能力,并影响肿瘤的起始和进展,本研究将进一步探究Nanog在肝癌免疫微环境中的作用和机制。本文主要的研究内容及研究结果如下:（1）过表达Nanog增强了小鼠肝癌细胞的肿瘤起始能力,抑制肿瘤内浸润的CD8+T细胞构建Nanog过表达的小鼠肝癌细胞系,通过流式分选纯化,RT-PCR、Western Blot实验,从RNA和蛋白水平验证Nanog过表达的肝癌细胞构建成功。通过不同剂量的细胞构建小鼠肝脏原位移植瘤模型,分析Nanog过表达组和对照组在不同剂量下小鼠的成瘤率和肿瘤增长速度,比较同一剂量下两组间的肿瘤体积差异,结果显示,过表达Nanog显著提高了肝癌细胞的成瘤能力,干细胞频率计算也显示过表达组中含有更多的肿瘤干细胞比例。通过小鼠肝癌组织的免疫荧光和免疫组化染色发现过表达Nanog组中浸润的CD45阳性的淋巴细胞减少,其中,CD8+T细胞比例降低,但PD-1+CD8+T细胞增加。（2）抑制Nanog表达联合PD-1单抗使用降低PD-1+CD8+T细胞占比,抑制肝癌生长根据前期研究工作和实验验证IGF-1R抑制剂PPP可以抑制Nanog基因的表达,通过设计PPP联合PD-1单抗治疗小鼠肝脏原位移植瘤,对比联合治疗和单独用药对肝癌的抑制作用,以及肿瘤内Nanog、PD-1和CD8的表达情况,发现PPP在体内抑制小鼠肝癌中Nanog的表达,同时,PD-1+CD8+T细胞减少。联合用药组相较于PD-1单独治疗组,肿瘤抑制效果更加显著。（3）肝癌中的Nanog通过巨噬细胞迁移抑制因子Mif影响CD38+CD74+巨噬细胞,从而使CD8+T细胞耗竭程度增加利用单细胞转录组测序研究过表达Nanog对肿瘤内浸润的CD8+T细胞的调控机制,通过比较过表达组和对照组中各类免疫细胞的含量情况,发现过表达Nanog组中巨噬细胞显著升高,同时,与免疫组化结果一致,CD8+T细胞降低。通过细胞聚类分析将巨噬细胞和T细胞亚类进行细分,结合细胞间互作分析,发现耗竭型CD8+T细胞亚群与CD38+CD74+巨噬细胞亚群关联紧密。此外,我们发现过表达Nanog的肝癌细胞高表达CD74的配体巨噬细胞迁移抑制因子Mif,通过生信分析发现Nanog可以转录调控Mif,而已有报道表明Mif/CD74信号调控巨噬细胞的增殖和免疫抑制状态。因此,综合以上的结果,我们推测过表达Nanog的肝癌细胞通过分泌Mif,影响CD38+CD74+巨噬细胞的功能,从而增加CD8+T细胞的耗竭程度,影响肿瘤的进展。综上所述,本课题阐明了Nanog通过调控CD8+T细胞的耗竭影响肿瘤的进展,并通过单细胞转录组测序揭示了CD38+CD74+巨噬细胞在Nanog调控CD8+T细胞耗竭中的作用,提出了一种基于PD-1单抗的联合治疗方法,为进一步全面认识肝癌中肿瘤干细胞的作用提供新的视角,同时为免疫检查点抑制剂临床治疗提供新的思路。