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[目 的]分析肝细胞生长因子(HGF)预处理骨髓间充质干细胞(BMSCs)对慢性肾病(CKD)大鼠肾功能以及肾组织纤维化的影响,并比较肾动脉和尾静脉两种移植途径的差异。[方法]1.SD大鼠BMSCs的分离培养鉴定及标记:4周龄清洁级SD大鼠2只,于超净工作台中取双侧股骨、胫骨,用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗骨髓腔后得BMSCs,培养并传至第5代,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成脂、成骨诱导分化培养检测细胞多向分化潜能。使用EDU对BMSCs进行体外标记,荧光显微镜下观察细胞标记情况。2.建立CKD模型及实验分组:采用尾静脉重复注射阿霉素(ADM)的方式造模。7周龄清洁级SD大鼠81只,ADM首次剂量为4mg/kg,两周后,以相同剂量再次注射,通过检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)值及24h尿蛋白水平分析大鼠肾功能,随机处死2只大鼠取肾观察其结构改变,确认模型大鼠符合CKD标准。随后将造模成功大鼠随机分成5组,每组各15只:①M组(模型组);②V-B组:尾静脉移植BMSCs;③V-HB组:尾静脉移植经HGF预处理的BMSCs;④A-B组:肾动脉移植BMSCs;⑤A-HB组:肾动脉移植经HGF预处理的BMSCs;⑥另取15只健康大鼠作为正常对照组(N组)。3.HGF预处理BMSCs:预处理组以20μg/L的HGF与BMSCs共培养24h,无预处理组不予以HGF共培养,而以低糖培养基(L-DMEM)培养。通过检测迁移能力和增殖能力,分析HGF对BMSCs的影响及作用。4.不同途径移植BMSCs对CKD大鼠肾功能及肾组织纤维化的影响:首次注射ADM后第10周开始予以EDU标记的BMSCs移植治疗。M组尾静脉注射PBS;V-B组尾静脉移植BMSCs;V-HB组尾静脉移植经HGF预处理的BMSCs;A-B组肾动脉移植BMSCs;A-HB组肾动脉移植经HGF预处理的BMSCs;N组尾静脉注射0.9%氯化钠溶液,上述注射体积均为0.5ml,细胞数为3×106个/ml。移植干细胞后第2周、第4周和第6周,通过检测Scr、BUN值及24h尿蛋白水平,分析BMSCs对CKD大鼠肾功能的影响;各组随机处死5只大鼠取肾染色,光学显微镜下观察大鼠肾脏形态结构改变和肾纤维化情况;荧光染色观察EDU标记的BMSCs在肾组织不同部位的分布情况;免疫组化染色比较转化生长因子β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达差异,分析BMSCs对肾组织纤维化形成的影响及其可能作用机制。[结 果]1.BMSCs分离培养鉴定及标记结果:原代BMSCs呈透明圆形,传代后为梭形,呈鱼群状或旋涡状贴壁生长,具有高增殖活性。CD45阴性表达(11.5%),CD90阳性表达(99.6%);成脂、成骨诱导分化培养阳性。综上,所得细胞为BMSCs,且使用EDU对其成功标记,细胞表达绿色荧光。2.建立CKD模型结果:注射ADM后第8周成功建立CKD大鼠模型。与N组比,M组大鼠Scr、BUN值和24h尿蛋白水平均显著升高(P<0.01)。HE染色见大量肾间质炎性细胞浸润伴结缔组织增生,大量肾小管腔内形成蛋白管型,肾小球囊腔扩张,大量肾小球损伤,毛细血管扩张、出现空泡变性。Masson染色见大面积肾间质蓝色着染胶原增生,肾小球囊周围胶原增生。PASM染色显示肾小球基底膜明显增厚。综上,成功建立CKD大鼠模型。3.HGF预处理BMSCs结果:与无预处理组相比,预处理组的BMSCs穿过膜的数量更多(P<0.05),在450nm处的吸光度值差异无统计学意义(P>0.05)。4.不同途径移植BMSCs对CKD大鼠肾功能及肾组织纤维化的影响:移植BMSCs能够改善大鼠一般情况,体质量逐渐增长;各治疗组大鼠的Scr、BUN值和24h尿蛋白水平均显著下降,其中A-B组大鼠的Scr、BUN值和24h尿蛋白水平在早期就较V-B组显著下降(P<0.05),而Scr和BUN值一直持续到第4周仍较V-B组低(P<0.05),提示BMSCs对受损肾组织具有积极地治疗效果,且在一定时间内,肾动脉途径要优于尾静脉途径。V-B组和V-HB组、A-B组和A-HB组两组的Scr及BUN值,其组间差异无统计学意义(P>0.05),仅在移植后第2周A-HB组的24h尿蛋白水平较A-B组低,此时观察到,A-HB组大鼠肾小管及肾小球中BMSCs数量较A-B组多,V-HB组肾组织中BMSCs数量也较V-B组稍多,提示HGF预处理有助于提高BMSCs的迁移能力,但在改善肾功能方面并没有显示出比单纯BMSCs更显著的治疗效果。A-B组和A-HB组的肾小管-间质损伤评分和纤维化面积百分比均较V-B组和V-HB组低(P<0.05),TGF-β1、α-SMA和FN的表达强度同样较V-B组和V-HB组低(P<0.05),然而整个实验过程中,A-B组和A-HB组、V-B组和V-HB组的组间差异无统计学意义(P>0.05)。提示经肾动脉移植BMSCs在延缓或抑制肾脏纤维化方面作用更显著,且该作用可能与减弱由TGF-β1介导的肾纤维化相关机制有关,虽然HGF预处理能够增加BMSCs靶向迁移至受损肾组织的数量,但对延缓肾纤维化方面在本研究中并没有展现出显著的增强作用。[结 论]BMSCs对肾功能具有积极地修复作用,能够延缓或抑制肾纤维化,其机制是通过下调TGF-β1的表达,减少ECM在肾组织过度沉积,且在一定时间内,经肾动脉移植BMSCs较尾静脉效果更佳;HGF预处理能够提高BMSCs的迁移能力,增加靶向归巢至受损肾组织的细胞数量,但对BMSCs改善肾功能及抑制肾纤维化方面并没有展现出显著的促进作用。