黄曲霉毒素B1对黄河鲤鱼的免疫毒性及其干预剂研究

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黄曲霉毒素(AFB1)是当前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一,其中以AFB1的毒性最强。水产饲料中使用植物成分以及加工或贮存过程控制不当就会容易被黄曲霉毒素污染。本文系统研究了AFB1对黄河鲤鱼的急性毒性及慢性毒性:对黄河鲤鱼生长性能及生理生化指标的影响,对鲤鱼非特异性免疫酶活的影响,对鲤鱼 IL-1β、TNF-α以及Lysozyme-C等免疫相关基因表达的影响,对鲤鱼Bcl-2、Bax及 Caspase-3等细胞凋亡相关蛋白表达的影响,组织病理学分析以及毒素在黄河鲤鱼组织中的积累。同时通过体外细胞培养研究了香菇葡聚糖 CED对 AFB1诱导的黄河鲤鱼淋巴细胞免疫毒性的保护作用,制备纳米化肉桂醛并研究了其抑制黄曲霉菌生长及产毒活性。最后通过动物学实验等验证了CED、纳米化肉桂醛等作为水产饲料中AFB1干预剂使用的作用效果。  本研究主要内容包括:⑴通过腹腔注射测得AFB1对黄河鲤鱼半致死剂量为12.3mg/kg体重,95%置信区间12.2-25.5mg/kg体重。随着注射AFB1浓度的升高,黄河鲤鱼血液中细胞呼吸爆发活性、免疫球蛋白 IgM、碱性磷酸酶呈现先升高后下降的趋势;溶菌酶活性、血浆总蛋白、白蛋白含量降低;谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性、补体3含量升高。经6.1mg/kgAFB1处理,鲤鱼肝脏SOD活性下降了11%,GSH含量下降了38%,MDA含量提高了28%,差异显著(P<0.05)。AFB1抑制了头肾、脾脏中IL-1β、TNF-α以及Lysozyme-C三个免疫相关基因的表达。表明AFB1一定程度上抑制了黄河鲤鱼机体免疫防御,诱导其肝脏发生氧化损伤。⑵通过90天不间断饲喂含AFB1的饲料,发现黄河鲤鱼表现出食欲下降、消瘦、活动减弱现象。1 mg/kg AFB1处理组鲤鱼增重率下降50%,饲料系数为对照组的2倍。鲤鱼的肥满度、肌肉必需氨基酸总量略有下降,差异不显著(P<0.05)。摄入1 mg/kg AFB1鲤鱼肝胰脏中AFB1含量高达6.1μg/kg,肌肉中AFB1含量却都低于0.5μg/kg。通过石蜡切片发现,鲤鱼肝脏、头肾、后肾、十二指肠等器官发生不同程度的病变。通过免疫组化分析发现,肝脏、肾脏细胞Bcl-2表达受到抑制,Bax表达升高,Bcl-2/Bax下降,Caspase-3表达升高。表明AFB1能够诱导黄河鲤鱼肝脏、肾脏细胞凋亡。⑶研究发现10、50μg/mL CED对黄曲霉菌产毒的抑制率分别达到70%、92%,而100、250、500μg/mL的CED对黄曲霉菌产毒的抑制率均达到100%。通过体外离体培养诱导方法,发现20μg/L AFB1能够显著抑制鲤鱼淋巴细胞活性,导致淋巴细胞内ROS水平、MDA水平显著升高(P<0.05);能够抑制淋巴细胞内的SOD、CAT、GSH活性,降低膜电位水平,诱导淋巴细胞崩溃。100μg/mLCED处理,可以有效提高淋巴细胞活性,降低胞内ROS、MDA水平,增强SOD、CAT酶活。CED可以有效抑制AFB1诱导的淋巴细胞线粒体膜电位崩解状态,提高淋巴细胞活性,增强鲤鱼免疫细胞的抗氧化防御系统。⑷通过制备纳米化肉桂醛,提高了肉桂醛的溶解性、稳定性以及对黄曲霉菌的抑制效果。选择乙酸乙酯作为油相,无水乙醇为助表面活性剂,吐温-80作为表面活性剂,Km=2:1(吐温-乙醇质量比值),制备的纳米化肉桂醛,形成了均一、稳定、透明的水溶性体系。纳米化肉桂醛在终浓度为0.6 mM时,可以有效地抑制黄曲霉菌菌丝生长,与肉桂醛相比,抑菌活性提高了50-100%。Nano-CA能够导致黄曲霉菌孢子发生更强烈的钙离子外流。虽然1mM肉桂醛也能够有效抑制黄曲霉孢子生长,但低浓度的肉桂醛(沙氏培养基中0.2mM、花生酱中0.25mM)一定程度上能够促进AFB1的产生。因此在黄曲霉毒素污染控制上,纳米化肉桂醛比肉桂醛更有效果。⑸10mg/kg、50mg/kgCED作为饲料中AFB1干预剂,能提高鲤鱼的增重率、鲤鱼含肉率及降低饲料系数;一定程度上提高细胞呼吸爆发活性、溶菌酶活性、碱性磷酸酶(AKP)活性、IgM含量、C3含量,降低血清中ALT及AST活性。表明CED作为饲料添加剂可以有效降低AFB1对黄河鲤鱼的毒害作用,促进鲤鱼的生长,提高鲤鱼的非特异性免疫力。而Nano-CA能提高鲤鱼的增重率及降低饲料系数,但降低了鲤鱼的含肉率。Nano-CA作为饲料中AFB1干预剂使用,性能不如CED。
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