香菇纤维素酶基因exg1的克隆及其表达

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我国是一个饲料资源十分紧张的国家,土地少、人口多,人畜争粮的矛盾十分突出。要保持我国饲料工业和畜牧业的持续发展,必须解决好饲料问题,否则将严重制约其发展。纤维素是植物光合作用的主要多糖类产物,由800-1200个葡萄糖分子聚合而成,是地球上最廉价、最丰富的可再生资源。全世界每年的植物体生成高达1500亿吨干物质,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨,但都被很少利用。因此,成功开发这一潜在饲料资源显得尤为迫切和重要。纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,它是一类复杂的复合物,称之为纤维素酶系,通常分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。近年来,随着分子生物学的飞速发展,通过基因工程途径,构建生产纤维素酶的高效基因工程菌已经成为研究的热点。  本研究通过RT-PCR技术,从亚洲香菇中克隆出香菇纤维素酶基因exg1,并分析了该基因的序列,构建了原核表达载体,通过SDS-PAGE对该基因表达的蛋白产物进行了分析,用CMC-Na法定性检测了重组菌产生的纤维素酶的活力。本研究主要取得了以下结果:  1.采用RT-PCR技术,从香菇的cDNA中分离出大小约1537bPexg1的片段。  2.利用载体pET-28a,构建原核表达载体pET-28a-exg1。验证分析表明,所克隆的exg1基因已置于表达载体的正确阅读密码框下。  3.包含pET-28a-exg1重组菌经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,蛋白的分子量大约为57kDa,通过与葡聚糖水解酶家族5(glycosyl hydrolase family5)的蛋白比对,同源性达94.9%;用CMC-Na法检测重组菌产生的蛋白有活力,结果显示pET-28a-exg1重组菌最佳诱导时间为3h。  4.利用载体pPIC9K,构建真核表达载体pPIC9K-exg1。
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