新型鹅星状病毒的分离鉴定及Cap蛋白多克隆抗体的制备

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自2017年以来,在我国广东、江苏、山东等鹅养殖基地爆发了一种以雏鹅痛风为主要特征的急性传染病。该病主要感染2周龄以内的雏鹅:其临床症状表现为雏鹅瘫痪,解剖病变为肝脏、脾脏和肾脏表面以及关节腔有大量尿酸盐沉积。发病鹅群的感染率大约为80%,死亡率大约为50%。目前认为引起该病的主要病原为鹅星状病毒。该病毒既能够在水平方向上通过粪口传播,也能够进行垂直传播,并且目前尚无针对该病毒的商品化疫苗等生物制品,对我国养鹅业造成了巨大的经济损失。近年来,在河北省部分养鹅场同样爆发了以雏鹅痛风为主要特征的传染病,临床检测星状病毒阳性率在90%以上。为了进一步确定河北省引发雏鹅痛风的鹅星状病毒特征,本研究对临床的阳性样品进行了病毒的分离鉴定。将患有痛风的雏鹅进行解剖。无菌采集患病鹅的肝脏组织进行研磨。将研磨液进行离心,上清通过0.22μM的滤器后接种1 1日龄的鹅胚。接种7天后收集尿囊液和胚体。通过RT-PCR检测发现鹅星状病毒能够在鹅胚进行增殖,并且未检测到新城疫病毒(ND),禽流感病毒(AIV),禽腺病毒(FAV),鸭坦布苏病毒(DTMUV),鹅细小病毒(GPV),鹅出血性多瘤病毒(GHPV)。将尿囊液接种到鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒的分离传代。在传至F5代后,接种鹅星状病毒的LMH细胞产生了细胞皱缩和脱落等细胞病变。通过间接免疫荧光也能够检测到病毒蛋白,说明病毒分离成功,命名为GAstV-HB株。该病毒在LMH细胞的滴度可达5×106TCID50/mL。将分离的病毒通过高通量测序进行全长基因组的测序,测序结果表明该病毒的基因组全长为7179bp,利用GAstV-HB株全长基因组序列和ORF2序列与其他各属的星状病毒进行序列分析,结果表明GAstV-HB株与其他火鸡源、鸡源、鸭源星状病毒同源性均较低,核苷酸同源性约为55%~63%;GAstV-HB株与GAstV-2型(JSHA株、SDPY株等)属于同一分支,其同源性约97%,而与GAstV-1型仅有约56%的同源性;GAstV-HB株与GAstV-2型的3个开放阅读框氨基酸序列同源性平均在97%左右,与其他火鸡源、鸡源、鸭源星状病毒同源性在30%-65%。所以GAstV-HB株属于基因2型鹅星状病毒,为新型鹅星状病毒。雏鹅致病性试验表明,GAstV-HB株感染雏鹅以后能够引起雏鹅的痛风症状,引起感染雏鹅体重下降,并且在感染后的1天出现排毒。鹅星状病毒ORF2基因编码的Cap蛋白是星状病毒的主要结构蛋白,也是变异速度最快的蛋白。为了建立针对鹅星状病毒的检测方法,本研究将GAstV-HB的ORF2序列进行优化。把优化后的序列克隆到pET-32a载体中,获得重组质粒pET-32a-ORF2。将pET-32a-ORF2转化到BL21感受态细胞,经过条件优化后,在IPTG浓度为1.4 mmol/L,温度在37℃条件下诱导4h表达量最大。诱导表达结果发现Cap蛋白主要以包涵体的形式表达,经蛋白纯化后SDS-PAGE结果显示单一条带,大小约为100KD。将纯化的蛋白通过常规免疫源程序免疫獭兔,经过四次免疫采取兔血,制备鹅星状病毒Cap蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光和免疫印迹试验证实该多克隆抗体能够与病毒发生反应,具有良好的反应原性。本研究成功分离到一株基因2型鹅星状病毒,并且制备了针对该病毒Cap蛋白的多克隆抗体,为研制鹅星状病毒相应的疫苗、卵黄抗体以及诊断制剂等相关生物制品奠定了基础,对该病毒的防控具有重要意义。
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