皮肤是人体最大的器官，皮肤除了表皮、真皮结构以外还有毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器官，构成了机体与外界接触的机械屏障，具有多种重要的生理功能。当皮肤遭受严重烧伤、创伤、感染及各种原因导致的皮肤损伤时，大面积皮肤缺损的快速修复成为棘手的问题。组织工程概念的提出为大面积皮肤损伤的修复提供了新的思路。组织工程皮肤中种子细胞的研究一直是研究的热点。毛囊是皮肤组织中的附属器官，毛囊中存在有高增殖活性和多分化潜能的干细胞即毛囊干细胞(Follicle stem cells FSC)。FSC作为一种新型的皮肤种子如何在体外大量增殖，关键在于筛选出快速获取FSC的分离技术，优化种子细胞的培养微环境，这已经成为组织工程皮肤种子细胞研究亟待解决的问题。研究目的：1．建立高效、快速的FSC分离和培养技术，优化FSC体外培养微环境。2．观察体外培养的FSC生物学特征及传代培养的FSC的细胞周期分布。3．比较FSC和表皮干细胞(Epidermal stem cells ESC)生物学特征。4．观察真皮来源的成纤维细胞(Fibroblast FB)对FSC增殖和分化潜能的影响。为FSC成为一种新型皮肤种子细胞提供实验依据。实验方法：1．分离、纯化兔触须部FSC，比较“快速分离法”和“两步酶”法的差异，通过CK19、β1整合素免疫组化染色鉴定FSC：2．采用MTT法考察FSC增殖活性，流式细胞仪分析传代FSC各周期细胞的分布；3．倒置显微镜下观察血清浓度对FSC黏附的影响，采用MTT法和细胞外LDH检测血清对FSC增殖活性的影响，比较FSC对不同浓度血清的依赖作用；4．分离、培养人头皮来源FSC，进行CK19、整合素免疫组化染色鉴定：5．比较FSC和ESC体外贴壁时间、贴壁率、贴壁后形态结构、生长曲线和表皮干细胞活性的差异，配对t检验分析比较FSC与ESC增殖活性的差异；6．分离培养FB，建立FB与FSC共培养技术，采用酶化学法检测培养体系中LDH活性，间接反映成FB对FSC活性的干预作用。通过FSC形态学的改变，研究真皮来源的FB对FSC多分化潜能的影响。实验结果：1．两种分离方法比较显示：“两步酶”法可以获取大量β1整合素、CK19表达阳性具有高增殖活性的FSC；2．传代FSC接种24h后含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum FBS)的K-SFM培养环境中细胞几乎全部贴壁：无血清的K-SFM中细胞未完全贴壁；MEM中细胞贴壁率最低且细胞均呈圆形，少数贴壁细胞的折光差。不同浓度FBS培养环境对FSC增殖影响结果显示：不同血清浓度各组间方差分析比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，FSC适宜培养环境为含10％胎牛血清的K-SFM的培养环境。3．FSC体外生长曲线显示：细胞3天后开始迅速增殖，一周后进入缓慢增殖期，随后进入长达30天的生长平台期。且发现在长期培养过程中细胞与细胞之间无明显的接触性抑制现象，流式细胞仪分析细胞周期结果显示：传代后的FSC处于增殖的G1期细胞占为73.6％，G1期细胞变异指数CV为3.9，获取的细胞均一性好。4．“两步酶”分离法同样可以从人头皮组织中获取大量CK19、β1整合素表达阳性的FSC；5．与ESC生长曲线相比，FSC具有更高的增殖活性且有一个相对较长保持高增殖活性的生长期。ESC中只有部分细胞表达β1整合素，FSC均表达β1整合素，细胞阳性率几乎100％；6．FB与FSC共培养后细胞外LDH检测结果显示：共培养的FSC增殖活性增强，单纯毛囊干细胞与共培养比较，统计学分析显示：差异有统计学意义(P＜0.05)。共培养后的FSC形态由短棒样梭形细胞变为表皮样细胞形态。实验结论：1．“两步酶”法是一种高效、快速获取CK19、β1整合素阳性表达的FSC的分离方法。2．获取的FSC具有高增殖能力，细胞均一且能够长期在体外扩增形成复层结构。3．血清提高加强K-SFM对FSC粘附和增殖作用，FSC适宜的培养环境是含10％FBS的K-SFM。4．与ESC相比，FSC不仅高表达β1整合素，且能较长时间在体外扩增，是一种比ESC更具优势的皮肤种子细胞。5．真皮来源的成纤维细胞对FSC增殖具有促进作用，FSC在与真皮来源的成纤维细胞共培养的条件下可能表现出多分化潜能。研究结果提示：FSC不仅获取容易，而且具有高增殖活性和多分化潜能的特点，是一种极具潜力的组织工程皮肤种子细胞。