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目的：
血糖升高诱导血管内皮老化是糖尿病患者血管并发症产生的重要病理机制。临床研究表明，间歇性高糖较持续性高糖对血管的损伤更大。辣椒素（ Capsaicin ， Cap ）是辣椒的主要活性成分，其机制主要与激活辣椒素受体（Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）有关，后者近来在糖尿病等代谢性疾病中的作用日益引起重视。我们前期研究发现TRPV1的另一天然激动剂吴茱萸次碱可上调血管内皮及平滑肌细胞中长寿基因SIRT1的表达，抑制高糖或Ang II诱导的细胞衰老。因此，本课题的研究目的是观察TRPV1的经典激动剂Cap对间歇性高糖诱导血管内皮细胞衰老是否有保护作用，并进一步探索其机制是否与激活TRPV1信号途径上调SIRT1有关。
方法：
（1）观察间歇性高糖和持续性高糖对内皮细胞衰老的影响，间歇性高糖组：用含有正常糖（5.5 mM葡萄糖）或高糖（33 mM葡萄糖）培养基交替培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）6天，每隔24 h换液，诱导血管内皮细胞损伤。持续高糖组：高糖培养基（33 mM葡萄糖）连续孵育6天。此外，预先加入SIRT1抑制剂EX527（10μM），确定SIRT1在高糖诱导的内皮细胞衰老中的作用。
（2）在间歇性高糖诱导的内皮细胞损伤模型，加入不同浓度的Cap（0.3μM， 1μM，3μM）孵育HUVECs，观察Cap对内皮细胞衰老及SIRT1水平的影响。
（3）探究Cap抑制内皮细胞衰老的机制：预先加入TRPV1拮抗剂Capsazepine （CAPZ，1μM），胞内钙螯合剂BAPTA-AM（10μM），钙调素激活的蛋白激酶ⅡCaMKⅡ 阻断剂KN62（5μM），AMPK阻断剂Compound C（1μM），观察其能否阻断Cap（1μM）的上调SIRT1表达及抗内皮细胞衰老的效应。
（4）进一步确定TRPV1在内皮细胞衰老中的作用：慢病毒转染构建TRPV1低表达稳转细胞株（TRPV1 shRNA），观察干扰TRPV1表达是否影响内皮细胞衰老及削弱Cap（1μM）的抗内皮衰老作用。细胞衰老相关检测包括：CCK-8实验检测细胞的活力，β-半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞，PI染色检测细胞周期阻滞情况，荧光探针DCFH-DA法检测细胞内活性氧的水平。Western blotting检测TRPV1， SIRT1和其下游的p21的表达水平及AMPK的磷酸化水平，RT-qPCR检测TRPV1， p53和p21的mRNA水平。
结果：
（1）间歇性高糖和持续性高糖均能显著诱导血管内皮细胞衰老，表现为降低HUVECs的细胞活力，增加衰老细胞的数目和细胞内活性氧的水平。而间歇性高糖诱导内皮细胞衰老的作用强于持续性高糖，抑制SIRT1表达及上调p21的作用更为显著。预先给予SIRT1抑制剂EX527可加重间歇性高糖诱导的细胞衰老。
（2）Cap可剂量依赖性地抑制间歇性高糖诱导的细胞衰老，表现为增加HUVECs的细胞活力，显著减少衰老细胞，抑制活性氧的水平，上调SIRT1蛋白的表达，抑制p53和p21的mRNA水平。流式细胞周期检测结果表明：间歇性高糖可使HUVECs的细胞周期阻滞在G0/G1期，而且降低处于增殖期细胞（S和G2/M）的百分比，预先给予不同浓度的Cap可解除间歇性高糖对细胞周期的抑制作用，上调细胞增殖期的百分比。
（3）间歇性高糖孵育的HUVECs中预先加入TRPV1阻断剂CAPZ，胞内钙螯合剂BAPTA-AM，钙调蛋白CaMKⅡ拮抗剂KN62，AMPK阻断剂Compound C均可部分取消Cap的抗内皮衰老作用。间歇性高糖可抑制HUVECs的AMPK磷酸化，预先给予Cap可恢复p-AMPK的水平，该效应可被CAPZ所阻断。
（4）Cap可剂量依赖性地上调HUVECs中TRPV1蛋白和mRNA的表达。与正常内皮细胞及转染对照阴性慢病毒的细胞相比，TRPV1 shRNA可降低内皮细胞活力，增加衰老细胞数量，下调SIRT1和p-AMPK表达，加重间歇性高糖诱导的内皮衰老，而预先给予Cap则未能发挥抗衰老作用。
结论：
Cap可以显著抑制间歇性高糖诱导的血管内皮细胞衰老，其抗衰老机制与激活TRPV1/Ca2+/CaMKⅡ/AMPK信号途径上调长寿蛋白SIRT1的表达，从而抑制衰老相关蛋白p53和p21的表达有关。
血糖升高诱导血管内皮老化是糖尿病患者血管并发症产生的重要病理机制。临床研究表明，间歇性高糖较持续性高糖对血管的损伤更大。辣椒素（ Capsaicin ， Cap ）是辣椒的主要活性成分，其机制主要与激活辣椒素受体（Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）有关，后者近来在糖尿病等代谢性疾病中的作用日益引起重视。我们前期研究发现TRPV1的另一天然激动剂吴茱萸次碱可上调血管内皮及平滑肌细胞中长寿基因SIRT1的表达，抑制高糖或Ang II诱导的细胞衰老。因此，本课题的研究目的是观察TRPV1的经典激动剂Cap对间歇性高糖诱导血管内皮细胞衰老是否有保护作用，并进一步探索其机制是否与激活TRPV1信号途径上调SIRT1有关。
方法：
（1）观察间歇性高糖和持续性高糖对内皮细胞衰老的影响，间歇性高糖组：用含有正常糖（5.5 mM葡萄糖）或高糖（33 mM葡萄糖）培养基交替培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）6天，每隔24 h换液，诱导血管内皮细胞损伤。持续高糖组：高糖培养基（33 mM葡萄糖）连续孵育6天。此外，预先加入SIRT1抑制剂EX527（10μM），确定SIRT1在高糖诱导的内皮细胞衰老中的作用。
（2）在间歇性高糖诱导的内皮细胞损伤模型，加入不同浓度的Cap（0.3μM， 1μM，3μM）孵育HUVECs，观察Cap对内皮细胞衰老及SIRT1水平的影响。
（3）探究Cap抑制内皮细胞衰老的机制：预先加入TRPV1拮抗剂Capsazepine （CAPZ，1μM），胞内钙螯合剂BAPTA-AM（10μM），钙调素激活的蛋白激酶ⅡCaMKⅡ 阻断剂KN62（5μM），AMPK阻断剂Compound C（1μM），观察其能否阻断Cap（1μM）的上调SIRT1表达及抗内皮细胞衰老的效应。
（4）进一步确定TRPV1在内皮细胞衰老中的作用：慢病毒转染构建TRPV1低表达稳转细胞株（TRPV1 shRNA），观察干扰TRPV1表达是否影响内皮细胞衰老及削弱Cap（1μM）的抗内皮衰老作用。细胞衰老相关检测包括：CCK-8实验检测细胞的活力，β-半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞，PI染色检测细胞周期阻滞情况，荧光探针DCFH-DA法检测细胞内活性氧的水平。Western blotting检测TRPV1， SIRT1和其下游的p21的表达水平及AMPK的磷酸化水平，RT-qPCR检测TRPV1， p53和p21的mRNA水平。
结果：
（1）间歇性高糖和持续性高糖均能显著诱导血管内皮细胞衰老，表现为降低HUVECs的细胞活力，增加衰老细胞的数目和细胞内活性氧的水平。而间歇性高糖诱导内皮细胞衰老的作用强于持续性高糖，抑制SIRT1表达及上调p21的作用更为显著。预先给予SIRT1抑制剂EX527可加重间歇性高糖诱导的细胞衰老。
（2）Cap可剂量依赖性地抑制间歇性高糖诱导的细胞衰老，表现为增加HUVECs的细胞活力，显著减少衰老细胞，抑制活性氧的水平，上调SIRT1蛋白的表达，抑制p53和p21的mRNA水平。流式细胞周期检测结果表明：间歇性高糖可使HUVECs的细胞周期阻滞在G0/G1期，而且降低处于增殖期细胞（S和G2/M）的百分比，预先给予不同浓度的Cap可解除间歇性高糖对细胞周期的抑制作用，上调细胞增殖期的百分比。
（3）间歇性高糖孵育的HUVECs中预先加入TRPV1阻断剂CAPZ，胞内钙螯合剂BAPTA-AM，钙调蛋白CaMKⅡ拮抗剂KN62，AMPK阻断剂Compound C均可部分取消Cap的抗内皮衰老作用。间歇性高糖可抑制HUVECs的AMPK磷酸化，预先给予Cap可恢复p-AMPK的水平，该效应可被CAPZ所阻断。
（4）Cap可剂量依赖性地上调HUVECs中TRPV1蛋白和mRNA的表达。与正常内皮细胞及转染对照阴性慢病毒的细胞相比，TRPV1 shRNA可降低内皮细胞活力，增加衰老细胞数量，下调SIRT1和p-AMPK表达，加重间歇性高糖诱导的内皮衰老，而预先给予Cap则未能发挥抗衰老作用。
结论：
Cap可以显著抑制间歇性高糖诱导的血管内皮细胞衰老，其抗衰老机制与激活TRPV1/Ca2+/CaMKⅡ/AMPK信号途径上调长寿蛋白SIRT1的表达，从而抑制衰老相关蛋白p53和p21的表达有关。