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目的:脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是脑卒中的亚型,约占15%-20%,致死率和致残率极高,并给个人,家庭和社会带来很大的经济负担。脑出血后的损伤主要分为血肿压迫后的原发性脑损伤和脑出血后红细胞的代谢产物等所致的继发性脑损伤。其中,继发性脑损伤所引起的神经炎症对脑出血的预后的影响尤为重要。目前临床上的治疗主要是采取内科的保守治疗和在具有手术适应症时辅以外科治疗,但治疗预后往往不良。因此,针对脑出血后神经炎症的靶向治疗研究颇为重要,值得我们去仔细的研究探讨。近年来,MicroRNAs(MiRs)治疗脑出血等神经疾病已经被广泛的研究,并具有很大的治疗前景。MicroRNA-23b(MiR-23b)位于人体9号染色体上,目前针对miR-23b的研究主要集中在肿瘤领域,对其在神经领域的研究知之甚少。近年来有研究人员指出miR-23b在自身免疫性脑炎患者中表达水平显著下调,并且能改善自身免疫性脑炎后的神经炎症。另外,在我们的前期研究中发现,miR-23b在脑出血患者的外周血和血肿周组织中表达水平显著下降,但是目前miR-23b在脑出血中的治疗作用的研究尚不明确,还需要我们进一步去探究。自噬,是细胞内的一种“自食”现象,是指降解受损细胞器及大分子物质以维持内环境稳定的过程,目前已证实了脑出血能够导致自噬的激活,但脑出血后的自噬激活和神经炎症之间相互作用的机制未清,以及miR-23b是否能参与该调控也未知,值得我们在本研究中去进一步探索。在本研究中,我们利用胶原酶Ⅶ脑立体注射和氯高铁血红素(hemin)刺激处理来构建脑出血的体内和体外模型,再通过过表达miR-23b,进而观察miR-23b对脑出血后的神经炎症的调控作用,对脑出血后自噬的调控以及对周围神经元细胞的存活情况的影响,可能为今后的miRs治疗脑出血提供新的理论依据。研究方法:在本研究中,将过表达miR-23b的慢病毒(LV-miR-23b)通过侧脑室注射到wistar大鼠(250-300g)中,两周后采用胶原酶Ⅶ立体定位注射的方法制作脑出血动物模型。动物实验共分成假手术组(sham组)、脑出血组、脑出血+慢病毒对照组(LV-miR-NC)、脑出血+过表达miR-23b的慢病毒组(LV-miR-23b)。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)来检测脑血肿周围组织的miR-23b的表达情况;通过转角实验(corner test)和前肢放置试验(forelimb placement test)来观察脑出血后的大鼠神经功能的缺损的改善情况;通过测量脑水含量(brain water content)来观察大鼠脑水肿的程度;通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)来分析脑组织切片中的血肿面积;通过免疫荧光(immunofluorescence)对脑切片中血肿周组织进行Iba1(ionized calcium binding adapter molecule 1)阳性染色;通过TUNEL法和神经元抗原抗体(NeuN)阳性染色来检测脑出血后血肿周围的神经元存活情况;使用蛋白免疫印迹法(western blotting)检测iNOS(inducible Nitric oxide synthase)、MCP-1/CCL2、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达水平变化来判断血肿周组织的炎症情况和细胞凋亡情况。在体外模拟脑出血模型中,我们使用氯高铁血红素(hemin)刺激小胶质细胞BV2,并与海马神经元细胞HT22共培养。通过酶联免疫法(Elisa法)测定BV2细胞的上清液中细胞炎症因子IL-6(Interleukin-6),IL-1β(Interleukin-1β)和TNF-α(Tumor necrosis factor–α,);通过一氧化氮试剂盒测定BV2细胞中一氧化氮(NO)的含量;通过蛋白免疫印迹法检测iNOS、MCP-1/CCL2、LC3B(Microtubule-associated proteins1A/1B light chain 3B)及SQSTM1/p62(Sequestosome-1)的表达变化;通过mRFP-GFP-LC3腺病毒感染检测细胞内自噬流的水平;通过流式细胞分析法和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定来检测神经元细胞HT22的凋亡情况。通过靶基因预测网站交叉预测miR-23b潜在的靶基因,并用realtime-qPCR进行筛选,双荧光素酶报告基因实验进行验证多磷酸肌醇激酶(Inositol polyphosphate multikinase,IPMK)是否是miR-23b的靶基因。最后通过使用干扰IPMK和自噬抑制剂,观察miR-23b是否通过降低IPMK的表达而抑制自噬,从而改善脑出血后的神经炎症和发挥神经保护作用。结果:1、miR-23b在脑出血大鼠脑组织中表达下调(P<0.05)。2、过表达miR-23b能有效改善脑出血大鼠的脑水肿程度(P<0.05),并明显减小血肿面积和脑组织损伤。3、过表达miR-23b能显著改善脑出血大鼠的神经功能缺损。4、miR-23b可以有效缓解脑出血后小胶质细胞的激活,和神经炎症因子的表达。5、miR-23b可以减少脑出血后血肿灶周神经元的凋亡。6、过表达miR-23b可以减轻hemin处理下小胶质细胞BV2的炎症因子的分泌,并改善与之共培养的神经元细胞的抗凋亡能力。7、miR-23b的过表达可以降低hemin处理下小胶质细胞BV2的自噬流的水平。8、miR-23b可以靶向降低细胞内IPMK的表达水平,并通过抑制自噬水平来改善脑出血体外条件的炎症反应,发挥神经保护功能。9、miR-23b可以激活AKT/mTOR通路抑制自噬。结论:1、miR-23b的过表达可以有效提高大鼠脑出血后的神经功能恢复。2、miR-23b可以改善大鼠脑出血后的神经炎症,及体外hemin处理下的小胶质细胞BV2细胞的炎症水平并提高神经元细胞的抗凋亡能力。3、miR-23b可以降低BV2的自噬水平,可以通过与IPMK mRNA的3’-UTR区结合,直接降低IPMK水平,进一步激活AKT/mTOR通路调控自噬水平,从而实现改善神经炎症、发挥神经保护的作用。miR-23b可以通过负性调控IPMK的表达水平,进一步激活AKT/mTOR通路来调控小胶质细胞内的自噬过程,从而改善脑出血后的神经炎症和发挥神经保护作用,促进脑出血大鼠的神经功能恢复,有望为脑出血的治疗提供新的策略。