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研究背景和目的宫颈癌（Cervical Carcinoma,CC）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见的妇科恶性肿瘤。我国是CC患病人数最多的国家之一,CC的预防和治疗任务繁重。HPV疫苗和宫颈涂片筛查虽然能够有效的预防CC发生,但晚期CC预后通常很差。环状RNA（circRNAs）在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用,这也包括在CC中。此外,由于具有高稳定性,特异性表达等特点,circRNAs在肿瘤的治疗与诊断中前景可期。然而,当前很大一部分circRNAs的表达和功能尚不清楚。本研究旨在探讨hsa＿circ＿0006332（Hsa＿circ00063322）和hsa＿circ＿0000069（Hsa＿circ0000069）在CC发展中的作用及其表达升高的相关分子机制。研究方法1.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069环状性质验证及其在宫颈癌细胞和组织中的表达通过RnaseR消化实验和基因组DNA扩增实验验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的环状结构。放线菌素D实验和核质分布实验检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的高稳定性和细胞分布。采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）法分别检测CC和正常组织与细胞中Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达,以确定宫颈组织癌变后Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达变化。2.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069表达升高的机制研究通过数据库分析,发现Hsa＿circ00063322表达可能受转录因子FOXA1调控,而Hsa＿circ0000069表达受RNA m6A甲基化修饰调控。通过染色质免疫共沉淀实验验证FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子结合;qPCR法检测FOXA1对Hsa＿circ00063322表达的调节;荧光素酶实验确认了FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子区的结合位点。m6A RNA免疫共沉淀（Me-RIP）检测CC和正常细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平,以及METTL3敲低后Hsa＿circ0000069的m6A修饰变化。qPCR法验证METTL3对Hsa＿circ0000069表达的调节。放线菌素D实验检测METTL3敲低对Hsa＿circ0000069稳定性的影响,以及两个m6A修饰位点处m6A修饰分别对Hsa＿circ0000069稳定性的影响。制备Hsa＿circ0000069 m6A修饰位点单突变体和双突变体,然后通过Me-RIP和qPCR实验检测Hsa＿circ0000069两处m6A修饰之间的关系。3.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的细胞功能制备并通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069稳定敲低的细胞。制备Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069瞬间过表达细胞。采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）和5-乙基-2′-脱氧尿苷（Ed U）检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的增殖能力。将Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞进行顺铂和氟尿嘧啶处理,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用划痕和Transwell实验检测Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的迁移能力。4.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别靶向调节miR-548q和miR-4426,miR-548q靶向抑制L2的表达通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别对miR-548q和miR-4426的调节关系,以及miR-548q对HPV16小衣壳蛋白L2的调节关系。荧光素酶实验验证Hsa＿circ00063322与miR-548q,Hsa＿circ0000069与miR-4426,以及miR-548q与L2的结合位点。qPCR检测肿瘤和正常组织中miR-548q,miR-4426和L2的表达。5.Hsa＿circ00063322/miR-548q/L2和Hsa＿circ0000069/miR-4426信号通路的验证采用qPCR检测Hsa＿circ00063322过表达以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时过表达或者Hsa＿circ00063322敲低以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时敲低后L2表达变化,采用免疫荧光（IF）、Ed U、流式和Transwell实验检测miRNA过表达以及circRNA和miRNA同时过表达或者miRNA敲低以及circRNA和miRNA同时敲低后细胞的功能表型变化。研究结果1.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ00063322的表达显著上调,利用Hsa＿circ00063322表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（ROC分析AUC=0.8597）。Hsa＿circ00063322具有高稳定性,主要分布在胞浆中。FOXA1是Hsa＿circ00063322的转录因子,与MYBL2（Hsa＿circ00063322亲本基因）启动子区在两个位点结合。2.制备Hsa＿circ00063322稳定敲低细胞系。Hsa＿circ00063322敲低可显著抑制CC细胞的增殖能力,并增加其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性;而Hsa＿circ00063322瞬时过表达可促进其增殖能力,并削弱其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性。3.Hsa＿circ00063322可与miR-548q靶向结合,并且调节miR-548q的表达。与癌旁正常组织相比,宫颈癌组织中miR-548q的表达显著降低,且miR-548q和Hsa＿circ00063322的组织表达水平负相关。4.miR-548q与L2转录本在两个位点结合,介导了Hsa＿circ00063322对L2表达的调节。Hsa＿circ00063322过表达阻遏了miR-548q的抑癌活性,而Hsa＿circ00063322敲低抑制了miR-548q抑制剂的促癌活性。5.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ0000069的表达显著上调,利用Hsa＿circ0000069表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（AUC=0.7901）。Hsa＿circ0000069具有高稳定性,主要分布在胞浆中。6.相比正常宫颈细胞,CC细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平显著升高。m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069稳定性。Hsa＿circ0000069转录本中存在两处m6A修饰位点,二者的作用相互协同。7.制备Hsa＿circ0000069稳定敲低细胞系。Hsa＿circ0000069敲低显著抑制了CC细胞的增殖和迁移能力,而Hsa＿circ0000069瞬时过表达促进了CC细胞的增殖和迁移能力。8.Hsa＿circ0000069可与miR-4426靶向结合,并且调节miR-4426的表达。Hsa＿circ0000069过表达阻遏了miR-4426的抑癌活性,而Hsa＿circ0000069敲低抑制了miR-4426抑制剂的促癌活性。研究结论1.CC中,转录因子FOXA1促进了Hsa＿circ00063322的表达,Hsa＿circ00063322通过吸附miR-548q,防止了L2被降解,并促进了CC细胞的增殖能力,削弱了CC细胞对化疗药物的敏感性。2.CC中,m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069的稳定性,Hsa＿circ0000069通过吸附miR-4426,促进了CC细胞的增殖和迁移能力。