研究背景丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染常引起慢性肝病,感染HCV25～30年后肝硬化发生率为5%-25%,HCV相关肝硬化患者10年后肝功能失代偿发生率为30%,肝细胞癌年发生率为1%-3%。目前尚无有效的疫苗预防。有效的抗病毒治疗可改善患者长期生存率与生活质量。因此,抗病毒治疗的长期目标为降低HCV相关肝硬化、肝衰竭与肝细胞癌的发生率,降低HCV相关病死率,改善患者生活质量。HCV感染一般病情缓慢进展,抗病毒疗效评价多采用短期的临床指标,包括病毒学应答、生化学应答与肝组织学应答等指标。其中病毒学应答指标中的持续病毒学应答(sustained virological response, SVR)是当前评判疗效的最主要指标。SVR是指治疗结束24周后应用敏感PCR方法检测血清HCV RNA仍为阴性,被视为疾病的“病毒学治愈”。干扰素(interferon, IFN)联合利巴韦林(ribavirin, RBV)是目前慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C, CHC)抗病毒治疗的标准方案。多项大型临床研究均表明,聚乙二醇干扰素(Pegylated interferon, Peg-IFN)联合RBV的方案SVR可达65%,疗效明显优于普通IFN联合RBV方案。HCV基因型是影响CHC患者抗病毒治疗应答的重要因素,不同基因型患者治疗疗程与方案不同,AASLD(?)临床指南推荐HCV 1型患者Peg-IFN联合足量RBV治疗疗程48周,而2型和3型患者应用Peg-IFN及低剂量的RBV治疗疗程24周,在患者开始抗病毒治疗前,应检测HCV基因型。HCV基因型分布存在明显地区和人群差异；HCV不同基因型和亚型感染者的临床表现、肝病严重程度存在差异。由于目前国内尚无市售HCV分型试剂盒可供使用,建立一种可靠、灵敏、简洁、实用的HCV基因分型技术,对丙型肝炎的临床研究和相关的分子流行病学研究均具有重要意义。影响抗病毒疗效的基线指标很多,其中患者基因型与基线HCV RNA载量是目前最重要的两个预测指标。其他指标还包括性别、年龄、体重、有无胰岛素抵抗以及肝脂肪病变与纤维化程度、是否酗酒以及是否使用静脉毒品等。这些预测指标有助于临床医生与患者对于可能的治疗结局有充分的认知,也可作为个体化治疗方案的依据。在中国、日本以及东南欧流行的HCV 1b基因亚型感染抗病毒治疗应答较差。对于HCV 1b型慢性丙型病毒性肝炎患者,单用普通干扰素治疗SVR率只有10%-40%,标准抗病毒治疗方案Peg-IFN联合RBV治疗也仅达到约40%-50%。而Peg-IFN联合RBV治疗费用昂贵、副作用大。因此,病毒相关因素如基因型的检测及lb型疗效的影响因素预测将有助于临床合理地选择病例进行干扰素的治疗,从而提高干扰素疗效。日本学者Enomoto等研究发现HCV lb型NS5A 2209～2248氨基酸序列氨基酸突变数目可作为干扰素抗病毒疗效的独立预测因素,并把该区命名为干扰素敏感性决定区(Interferon sensitivity determining region, ISDR)。他们认为野生型株(HCV J)为耐干扰素株,其他病毒株的ISDR序列如与之相同则为野生株,会对IFN无应答；如与野生型株ISDR序列相差4个氨基酸以上为突变株,对IFN持续应答；差别在1-3个氨基酸之间为中间型,以无应答为主。随后日本学者的系列研究证实了这个发现。M Pascu等进行Meta分析认为：ISDR氨基酸残基突变在HCV lb型患者中可以做为一个亚型用于预测IFN治疗的应答反应,可用于预测IFN治疗疗效。然而有关ISDR国内是否可做为HCV治疗的预测因素仍存在争议。唐振亚等对武汉地区12例IFN治疗患者进行研究,认为中国分离株ISDR高度保守,中国的野生株对干扰素治疗产生SVR；胡芸文等发现上海丙型肝炎患者血清HCV的ISDR序列相对保守,干扰素治疗前24份血清HCV病毒株均为ISDR野生型株和中间型株,未发现突变株,认为国内少见ISDR氨基酸残基突变,ISDR不能做为疗效预测因素。然而,他们的研究对象为普通干扰素治疗患者,样本量过小,未进行统计分析；而Shen等对江苏地区应用IFN治疗的20例患者进行回顾性分析,认为ISDR氨基酸残基突变影响干扰素治疗疗效,Yen等对及台湾地区应用Peg-IFN联合RBV治疗的60例患者ISDR氨基酸残基突变与SVR显著相关。国内有关Peg-IFN联合RBV治疗的HCV 1b慢性丙型病毒性肝炎ISDR氨基酸残基突变的研究尚未见报道。本研究主要从影响疗效的HCV病毒学因素方面进行研究,包括以下三部分组成：1、采用RDH法建立HCV基因分型技术；2、建立一种以HCV 1b型ISDR特异性引物为基础的RT-PCR法,对广东地区HCV ISDR进行序列测定,了解广东地区ISDR氨基酸残基突变的分布情况；3、回顾性分析ISDR及治疗前、随访后等临床资料,分析ISDR氨基酸残基突变对Peg-IFN联合RBV治疗lb亚型CHC的影响因素,探讨影响SVR的主要预测因素及ISDR的临床意义。具体内容如下：一、反向点杂交技术检测丙型肝炎病毒基因型的方法建立与应用目的：建立HCV基因分型技术PCR-反向点杂交法(PCR-RDH)方法：应用生物信息学软件针对HCV 5’端非编码区(5’UTR)和核心蛋白区(C)设计特异性捕获探针及生物素标记引物,建立HCV基因分型的PCR-反向点杂交技术。应用本技术对115份丙肝血清标本进行基因型和基因亚型检测,同时对其中38份标本中的HCV进行RT-PCR基因扩增、测序、系统进化树分析确实HCV基因型和亚型,以评价反向点杂交法的准确性及临床应用价值。结果：115份血清标本中,反向点杂交法基因型及基因亚型检出率为96.5%(111/115),15份阴性对照全部为阴性。111例基因型明确标本中lb型63例(56.8%)；2a型9例(8.1%)；3a型4例(3.6%),3b型6例(5.4%)；6a型28例(25.2%),1b/2a混合型1例(0.9%)。经测序分型确定此法检测准确度为100%,特异性为100%。HCV基因型反向点杂交法检测准确可靠、简单经济、高效,适用于临床检测。与10余年前研究相比,目前广东地区的HCV基因型分布仍以lb型为主,但呈现出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势。二、HCV 1b型ISDR的检测方法的建立目的：建立一种以HCV 1b型ISDR特异性引物为基础的RT-PCR方法,对广东地区HCV ISDR进行序列测定,了解广东地区ISDR氨基酸残基突变的分布情况。方法：根据已知GenBank中的HCV 1b基因型D90208的全长序列及参考文献设设计HCV 1b NS5A ISDR引物序列,选择南方医院感染内科门诊就诊和住院的55例HCV 1b型慢性丙型肝炎患者的血清提取HCV RNA,采用巢式PT-PCR,扩增HCV 1b NS5A的ISDR,并与HCV J株进行序列比对确定ISDR区氨基酸残基突变数目,分析广东地区HCV 1b型患者ISDR分布情况。结果：HCV ISDR区扩增产物全长249bp,电泳显示条带清晰,大小符合预期分子量,无非特异性条带扩增,测序结果经BLAST分析为目的片段。广东地区HCV 1b型ISDR分布为：ISDR野生株(无突变)占25.5%(14/55),中间型(突变数目1一3个)占72.7%(40/55),突变株(突变数目超过3个者)占1.8%(1/55)。变异对ISDR联合RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响Peg-IFN目的：探讨广东地区患者HCV 1b变异对ISDR联合RBV抗病毒Peg-IFN治疗的影响因素及临床意义。方法：选择经检测并接受ISDR联合RBVPeg-IFN治疗的型CHC44例患者进行回顾性分析。结果：SVR率为43.2%(19/44),HCV 1b组与Peg-IFNα-2a组SVR相比,两者无统计学差异(P=0.797)；Peg-IFNα-2b氨基酸残基突变数目>2个与早期病毒学应答及SVR显著相关(P=0.018ISDR及氨基酸残基突变与EVR及SVR有统计学差异,而与P=0.005), ISDRETVR无统计学差异(P=0.056)：在年龄组(年龄≤40岁)中,ISDR与年龄相关(P=0.012),年龄小则ISDR突变数目多；ISDR与输血及非输血传播途径无关(P=0.117)。;ISDR 2218位氨基酸突变最多,在SVR组中突变中有14例(14/18,占77.8%),NR组中11例(11/15,占73.3%),无统计学差异(P=0.767)。多因素Logistic回归分析显示：影响SVR的最主要因素是ISDR氨基酸残基突变(OR=17.038,95%可信区间为：1.923-150.944,P=0.011),其次是年龄≤40岁(OR=12.259,95%可信区间为：0.012～0.559,P=0.011),AST影响SVR (OR=1.021,95%可信区间为：1.003～1.039,P=0.020)。结论：1、本研究建立的PCR-反向点杂交法对我国常见的HCV基因亚型lb、2a、3a、3b和6a检测的准确性、特异性及灵敏度较好,适宜我国临床推广应用；2、广东地区的HCV基因型分布仍然以1b型多见,呈现出lb型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势；3. HCV ISDR区扩增顺利,无非特异性条带扩增,测序及BLAST分析为目的片段,方法可靠。广东地区HCV 1b型ISDR分布以野生株及中间株为主,多突变株比例较低(1.8%)4、聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗广东地区HCV 1b型CHC患者SVR率为43.2%(19/44), Peg-IFNα-2a组与Peg-IFNα-2b组SVR相比无统计学差异；5、ISDR氨基酸残基突变数目≥2个与早期病毒学应答及SVR相关；ISDR氨基酸残基突变与输血及非输血传播途径无关；6、广东地区ISDR氨基酸残基突变以2218位氨基酸突变居多,但对SVR的影响未见统计学差异,需扩大样本深入研究；7、ISDR氨基酸残基突变数目、年龄≥40岁和AST是Peg-IFN联合RBV治疗CHC 1b型患者获得SVR的独立预测因素,其中ISDR氨基酸残基突变数目和年龄≥40岁对SVR的影响最大(OR=17.038, OR=12.259);8、ISDR氨基酸残基突变对SVR的影响可能与HCV病毒进化相关。