研究背景随着社会竞争的日益激烈,工作和生活节奏越来越快,人们所承受的压力和挑战变得越来越多,即大家每天暴露于日常生活应激的频率和强度都愈来愈大。持续、过强的应激严重地影响着我们的身心健康,并可能会引发一系列严重危害人类身心健康的应激相关性疾病。应激已经成为人类多种重大疾病的重要病因和诱因,而且越来越多的文献报道其与抑郁症发病的关系尤为密切。抑郁症以显著而持久的心境低落或对各种日常活动的兴趣缺失为主要特征,因其高发性、高致残性以及对家庭和社会造成沉重的经济和社会负担而引起人们的高度重视,抑郁症目前已经是导致全球疾病负担的一个重大因素。全球约有超过3.5亿人患有抑郁症,美国等发达国家抑郁症患病率较高,我国抑郁症的发病率约为3%-5%,老年人群抑郁症患病率较高,癌症患者抑郁症患病率明显升高。因此,对应激导致抑郁症的发病机制进行深入研究,继而为抗抑郁药的开发和临床应用,以及探寻有效的防治策略具有非常重要的社会及经济意义。抑郁症的发病机制非常复杂,然而迄今为止具体机制仍不清楚。目前主要有神经递质学说、神经回路学说等,这些学说认为抑郁症主要是由于脑内去甲肾上腺素、胆碱、5-羟色胺和多巴胺等神经递质或调质失衡及下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱所致。同时近几十年来细胞因子学说在抑郁症的发生发展机制中受到越来越多研究者的关注。细胞因子学说也称炎性反应学说,是基于抑郁症患者存在免疫学的改变而提出的,该学说认为过度活化的免疫系统所产生的炎性细胞因子在抑郁症的发病机制中起重要作用。目前细胞因子学说已有系列临床试验和动物实验的研究结果予以证实,因而抗炎治疗也逐渐成为抑郁症防治新的研究方向。国内外相关研究发现多种细胞因子参与抑郁症的发生,白细胞介素-1b(IL-1b)在抑郁症的发病机制中扮演着重要的角色,其与应激所致的情绪、行为异常等密切相关。IL-1b前体的剪切成熟需要IL-1b转化酶,而IL-1b转化酶是一种多蛋白复合体-炎性小体的重要组分。炎性小体由于其在固有免疫系统免疫功能的发挥及一系列炎症性疾病的发生机制中举足轻重的作用受到了国内外研究者的广泛关注。NLRP3炎性小体是目前研究的较为深入的炎性小体之一,其由NOD样受体、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1(即IL-1b转化酶)组成,能够促进IL-1b、IL-18和IL-33的剪切与成熟。NLRP3炎性小体可被感染、活性氧ROS、损伤及代谢产物、三磷酸腺苷ATP等多种外源性或内源性应激因素激活。国外研究者综述抑郁症发病的炎性机制相关文献后提出,NLRP3炎性小体可能在抑郁症发病机制中扮演重要作用,但NLRP3炎性小体是否及如何参与抑郁症发生的分子机制并不清楚,包括NLRP3炎性小体激活的上下游信号通路,以及NLRP3炎性小体激活的靶组织和靶细胞等。而且,应激能否激活NLRP3炎性小体导致抑郁症发生也未见文献报道的直接证据。深入研究应激因素如何活化NLRP3炎性小体进而诱导抑郁症发生的分子机制,不仅有利于阐释抑郁症的发病机制,还有助于为其它应激性疾病的防治提供新的思路及实验依据。研究目的本课题通过构建急、慢性小鼠抑郁症模型,拟证实NLRP3炎性小体是脂多糖(LPS)和应激诱导小鼠抑郁样行为的关键靶点之一,初步阐明应激激活NLRP3炎性小体可能的信号转导通路和分子机制,并探究抑郁症干预新的靶点,为抑郁症等应激性疾病的防治提供新策略。首先,观察急、慢性小鼠抑郁症模型中NLRP3炎性小体是否激活。通过免疫蛋白印记实验检测NLRP3炎性小体蛋白表达、实时定量PCR实验检测NLRP3炎性小体m RNA表达,以及通过免疫荧光双标定位NLRP3炎性小体在脑内激活的靶细胞等。其次,研究NLRP3炎性小体在抑郁症模型中的作用。给予NLRP3炎性小体抑制剂抑制NLRP3炎性小体活性后,检测NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白的表达变化,并通过行为学指标观察模型小鼠抑郁样行为能否得以改善。最后,探索LPS和应激激活NLRP3炎性小体的信号转导机制。通过检测LPS和应激诱导的抑郁症动物模型脑组织中活性氧ROS生成、P2X7受体及NF-κB蛋白的表达变化等,以及用富氢水阻断活性氧ROS生成后,NLRP3炎性小体通路蛋白的表达变化,以探索NLRP3炎性小体的激活途径。研究方法动物模型:利用LPS和慢性不可预见性应激(CUMS)建立急、慢性小鼠抑郁症模型,通过检测抑郁样行为指标,包括糖水偏爱实验、强迫游泳实验和悬尾实验等,检验动物模型造模成功与否。NLRP3炎性小体通路抑制剂:NLRP3炎性小体通路上游靶点的抑制剂如ROS生成抑制剂富氢水,下游靶点IL-1b转化酶Caspase-1的特异性拮抗剂YVAD和VX-765。NLRP3炎性小体的表达:免疫蛋白印迹实验、实时定量PCR实验、免疫荧光实验和酶联免疫吸附实验等检测NLRP3炎性小体的蛋白和m RNA的表达变化。炎性细胞因子检测:通过高通量蛋白悬液芯片法和酶联免疫吸附法等检测LPS和应激诱导抑郁症相关细胞因子IL-1b、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和白细胞介素-6(IL-6)等的表达水平。信号通路分子检测:通过高通量检测试剂盒和蛋白免疫印迹实验等,检测活性氧ROS、P2X7受体以及NF-kB炎性通路等关键蛋白的表达变化。研究结果(一)NLRP3炎性小体参与急性抑郁症1、通过糖水偏爱实验和强迫游泳实验观察LPS诱导的小鼠行为变化,腹腔给予脂多糖24小时后小鼠出现抑郁样行为。2、通过蛋白悬液芯片技术和实时定量PCR技术检测LPS诱导的抑郁样行为小鼠脑内IL-1b蛋白和m RNA表达水平,二者均明显升高。3、检测LPS诱导的抑郁样行为小鼠脑中NLRP3炎性小体各组分的m RNA表达水平,NLRP3、ASC和Caspase-1表达水平均明显升高。4、小鼠腹腔注射LPS半小时前予以腹腔注射NLRP3炎性小体特异性阻断剂YVAD,通过糖水偏爱实验和强迫游泳实验观察LPS诱导的小鼠抑郁样行为变化,NLRP3炎性小体特异性阻断剂YVAD可以显著减轻抑郁样行为。(二)NLRP3炎性小体参与慢性抑郁症1、通过糖水偏爱和悬尾实验观察到,CUMS四周后小鼠出现抑郁样行为。2、通过酶联免疫吸附法检测小鼠血清皮质酮水平、蛋白免疫印迹实验检测IL-1b蛋白表达水平,发现应激四周后皮质酮水平显著升高,海马组织中IL-1b的前体明显减少,而活化的IL-1b显著增加。3、通过对IL-1b转化酶Caspase-1活性检测,发现应激四周后小鼠海马中Caspase-1活性明显增加;通过蛋白免疫印迹实验发现,NLRP3炎性小体其他两个组分NLRP3和ASC的表达水平也明显增加。4、在慢性应激刺激的同时,每天给予小鼠腹腔注射NLRP3炎性小体特异性拮抗剂VX-765,四周后检测发现应激所致的Caspase-1活性增加得到了显著抑制,NLRP3和ASC的蛋白表达水平也明显下降。5、通过蛋白悬液芯片技术检测血清和海马中IL-1b水平发现,给予NLRP3炎性小体特异性抑制剂VX-765能明显抑制应激所致的IL-1b蛋白表达升高,同时糖水偏爱实验和悬尾实验也表明小鼠抑郁样行为得到明显改善。(三)富氢水可预防慢性抑郁症1、在慢性应激刺激的同时,每天给小鼠饮用富氢水,通过糖水偏爱和悬尾实验发现,应激所致的抑郁样行为得到了明显改善,而且富氢水明显缓解了应激所致的体重减轻。2、通过酶联免疫吸附实验检测小鼠海马和皮层IL-1b蛋白表达水平发现,富氢水可以显著抑制应激所致的IL-1b蛋白表达升高。3、通过IL-1b转化酶Caspase-1激活荧光检测试剂盒检测发现,慢性应激四周后小鼠海马和前额叶皮层Caspase-1均明显激活,而富氢水可以显著抑制应激所致的Caspase-1激活。4、通过活性氧ROS检测发现,慢性应激四周后小鼠海马和前额叶皮层ROS生成均明显增加,而富氢水可以显著抑制应激所致的ROS生成。结论NLRP3炎性小体通过IL-1通路在LPS和慢性应激所致的抑郁样行为中发挥重要作用,NLRP3炎性小体抑制剂和富氢水可以明显改善模型动物的抑郁样行为。