论文部分内容阅读
为了揭示希金斯刺盘孢与拟南芥互作过程中致病的分子机理,本研究首先构建由农杆菌介导的希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.) T-DNA插入突变体库(ATMT),通过将突变体分生孢子接种到离体和活体的拟南芥叶片,观察叶片发病症状及突变体侵染结构的形成情况。共获得致病力变化突变体6株。突变体CH-1-T734,无致病力,附着胞白化不能穿透拟南芥叶片表皮细胞；突变体CH-1-T45,无致病力,附着胞正常黑化但是丧失对拟南芥叶片表皮细胞的穿透能力；突变体CH-1-T679, CH-1-T732和CH-1-T801,弱致病力,附着胞黑化可产生初生菌丝和次生菌丝,均可诱发拟南芥产生过敏性坏死反应；突变体CH-1-T513,弱致病力,产生泡状侵染菌丝。通过Southern blotting验证,发现突变体CH-1-T734和CH-1-T732是T-DNA单拷贝插入,CH-1-T513是T-DNA双拷贝插入,CH-1-T679和CH-1-T801是T-DNA插入叁拷贝以上突变体。本试验利用TAIL-PCR结合Inverse PCR技术克隆突变体CH-1-T734、CH-1-T732和CH-1-T513的T-DNA侧翼序列。突变体CH-1-T734, T-DNA插入破坏的基因全长为2717bp,含有5个外显子,编码681aa。分析表明T-DNA插入在该基因的外显子区。将推定的氨基酸序列进行同源性比较,发现该序列与Collectotrichum gloeosporioides的Hypothetical protein的相似性达到90%,该基因的功能尚未报道。将此菌株在PDA上培养,菌落不产生黑色素,菌落颜色前期为白色,后期变为玫瑰红,且附着胞不黑化,因此推测该基因可能是影响C. higginsianum黑色素生物合成或代谢调控的新基因,并将此基因命名为Ch-MEL1。通过利用对Ch-MEL1基因的敲除和互补技术,验证该基因与希金斯刺盘孢的附着胞黑色素化、附着胞对寄主的侵入能力及侵染菌丝的产生能力密切相关。突变体CH-1-T513,分析表明T-DNA分别插入到两个不同基因的启动子区。其中一个被破坏的基因侧翼序列与C. higginsianum的Major facilitator superfamily transporter (MFS transporter)氨基酸相似性达到100%。另一个被破坏的基因侧翼序列与C. higginsianum的aldo/keto还原酶基因氨基酸相似性达到100%。分别对以上两个被破坏的基因进行基因互补试验,结果表明MFS transporter基因的破坏是突变体致病性状及相关生物学性状变异的主要因素。CH-1-T513在PDA平板上培养产生大量泡状菌丝；在接种拟南芥第4天后,突变体可产生黑化的附着胞,附着胞产生初生菌丝体和次生菌丝,但是初生菌丝向次生菌丝转化出现泡状异常菌丝。与野生型菌株相比较,该菌丝体细胞的内含物中含较少的脂质体,富含线粒体,细胞出现菌丝嵌套结构即菌丝内菌丝现象。因此推测该基因的破坏可能致使细胞膜内外营养物质和代谢产物转运的紊乱从而导致菌丝体细胞膨大及菌丝内菌丝现象,而这种改变可能并不影响寄主与病原物原有的识别系统,但是却影响突变体侵染菌丝对拟南芥的进一步扩展。突变体CH-1-T732, T-DNA插入破坏的基因全长为2999bp,含有3个外显子,编码669aa,分析表明T-DNA可能插入在该基因3’末端的非翻译区(距离基因3’翻译末端167bp)。将推定的氨基酸序列进行同源性比较,发现该序列与Asperqillus oryzae的铜胺氧化酶基因的相似性达到98%。该基因可能在C. higginsianum与拟南芥互作过程中与活性氧的信号传递有关。