论文部分内容阅读
由于众多药物靶点位于细胞内部,药物分子往往需要进入胞内才能与适宜靶点相互作用进而产生治疗效果。传统制剂给药后,药物分子通常通过血液循环分布至全身器官和组织;但是,仅依靠其扩散作用往往难以实现药物高效入胞并到达靶位,不仅治疗效果大打折扣,还会由于脱靶导致明显的毒副作用。近年来,纳米载体为高效精准递送药物入胞至靶位带来了希望,但是机体内复杂的多重生理屏障严重阻碍了纳米载体的输运及递药效率。精密设计的纳米载体进入肿瘤等病变组织后,若要进一步达到胞内靶点,载体必须克服由胞外基质、细胞膜以及胞内基质构成的三重递送屏障。其中,胞外基质和胞内基质中富含蛋白纤维,其相互交联形成网格状生物凝胶屏障,孔径分布在数十至数百纳米,严重阻碍载体的扩散。磷脂双分子层构成的细胞膜则作为细胞边界,对外部物质进入细胞起到重要的屏障作用。因此,理想纳米载体必须能够快速克服胞外基质屏障并扩散至细胞附近,进一步克服细胞膜屏障入胞,随后克服胞内基质屏障高效输运至靶位,最后释放足量药物发挥治疗作用。然而,现阶段的传统纳米载体很难高效序贯克服上述三重屏障将药物递送至胞内靶位。因此,需要对载体进行更合理的设计来提高其递送效率。自然界中的包膜病毒主要由外层磷脂膜和内部大小不一的核衣壳构成,两者之间并未完全贴合,形成特殊的非贴壁型核壳结构,这对其高效克服多重生理屏障将核酸递送至宿主细胞内部,起到了至关重要的作用。该现象启发我们:可以模拟包膜病毒的核壳结构及其侵袭功能设计纳米载体,通过改变核心尺度筛选可高效克服胞外基质屏障的优势核壳结构;进一步控制载体与细胞发生膜融合,顺利释放载药核心入胞;通过优化核心粒子修饰策略,促进核心粒子在胞内基质中快速输运到靶位释药。基于以上设想,开展了如下研究。本研究分为两部分,在第一部分研究中,启发于包膜病毒的核壳结构有助于其高效穿透胞外屏障,且释放的内部核衣壳可进一步在胞内基质中快速运动的特点,首先制备并筛选了可高效克服胞外基质屏障的优势核壳结构纳米载体,并通过优化核心粒子修饰策略,提高了核心粒子在胞内基质中的输运能力,为后续序贯克服胞外基质-细胞膜-胞内基质三重屏障奠定基础。通过微流控设备,制备了以磷脂膜为外壳、不同尺度球形介孔二氧化硅纳米粒为核心的核壳结构载体。它们具有相似的水化粒径（204.3 nm左右）和表面电荷性质（-25.4 m V左右）。通过胞外多粒子追踪及超高分辨显微技术观测,证实与包膜病毒结构类似的非贴壁型核壳结构纳米载体Lip@S60和Lip@S100可高效克服胞外基质屏障,其均方位移MSD值是普通贴壁型核壳载体的2-5.6倍。为模拟包膜病毒核衣壳的胞内运动过程,实现核心粒子高效克服胞内基质屏障的输运效果,进一步对S60及S100两种核心粒子进行筛选及修饰。通过胞内多粒子追踪及蛋白冠冕实验发现,外部包裹PEG化磷脂膜的S60核心粒子（LM）在胞内基质中输运时,由于其表面电荷为近中性（-6.7 m V左右）,导致蛋白吸附量少并能快速运动,其MSD值是未修饰S60粒子的32.1倍,验证了筛选出的LM核心粒子可在胞内基质中快速扩散,是高效克服胞内基质屏障的适宜选择。第一部分研究中,我们筛选得到了可高效克服胞外基质屏障的非贴壁型核壳结构纳米载体;并对其核心进行了优化,得到PEG化磷脂膜包裹的S60（LM）核心粒子,可在胞内基质中快速输运。为了序贯克服胞外基质-细胞膜-胞内基质三重屏障实现胞内高效递药,进一步提高仿包膜病毒的核壳结构高效入胞的功能并整合上述核壳结构以及核心、外壳的各自优势,实现高效递药,我们开展了第二部分的研究内容。本研究的第二部分,选择具有明显胞外基质-细胞膜-胞内基质三重屏障特征的实体瘤模型评价纳米载体的递送功能。启发于包膜病毒膜融合入胞的侵袭机制,在第一部分筛选出的优势核壳结构及核心粒子的基础上,进一步针对细胞膜屏障,将普通磷脂外壳更换为具有膜融合潜力的同源癌细胞膜,成功构建出高效序贯克服胞外基质-细胞膜-胞内基质三重屏障的仿包膜病毒核壳结构纳米载体（CCM@LM）。CCM@LM的粒径约为188.5 nm,表面电荷约为-23.8 m V,可高效包载抗肿瘤药物阿霉素和美呋哌瑞,包封率分别为93.7±1.3%和76.7±1.7%。给药后,CCM@LM首先凭借其癌细胞膜外壳获得良好的同源肿瘤靶向及免疫逃逸能力,可长时间（24 h以上）蓄积在肿瘤组织而不被机体快速清除。进入肿瘤组织后,具备非贴壁型核壳结构的CCM@LM可高效克服胞外基质屏障,其MSD值和肿瘤渗透量分别比CCM囊泡组高44.9和23.3倍。进一步,通过荧光共振能量转移和胞内单粒子追踪技术验证了CCM@LM利用类似包膜病毒的膜融合方式克服细胞膜屏障,随后顺利释放LM核心粒子入胞;核心粒子可以高效克服胞内基质屏障,快速输运至细胞核周围,促进药物高效入核。最终,仿包膜病毒核壳结构纳米载体CCM@LM荷载低剂量阿霉素和美呋哌瑞后表现出明显强于一线化疗制剂Doxil的抗肿瘤效果,抑瘤率高达95.0%。因此,本研究启发于包膜病毒的结构及功能设计药物载体,使载体高效序贯克服胞外基质-细胞膜-胞内基质三重递送屏障,从而显著提高药物递送效率及抗肿瘤效果。这份工作为后续针对多重生理屏障设计高效药物递送载体提供了新的思路和方法。