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本实验是将免疫层析和金标记技术结合起来,研究一种能够快速、简便、经济的方法来检测植物病毒。用提纯植物病毒免疫兔子和克隆病毒外壳蛋白基因然后原核表达,回收蛋白,再免疫兔子两种方法制备了烟草花叶病毒、李属坏死环斑病毒等病毒的抗体,所得多克隆抗体效价和特异性都比较理想。本实验以烟草花叶病毒为主要模式病毒进行了系统研究。
所研制的烟草花叶病毒胶体金免疫层析试纸条,检测试剂为喷涂在结合释放垫即玻璃纤维上的胶体金标记的兔抗TMV的多克隆抗体,捕获试剂为包被在硝酸纤维素膜上的兔抗TMV的多克隆抗体。用该试纸条检测TMV的标准液时,检测下限为50ng/ml。这一灵敏度达到了国外进口的试纸条检测水平。交叉反应试验结果表明,该试纸条与PVX、ZYMV、WMV、PenMV、CYMV以及PNRSV等病毒均无交叉反应。在特异性方面,该方法与ELISA方法进行了比较,结果显示两种方法的相符率达到98%。此外,本实验也成功研制了马铃薯X病毒(PVX)、白草花叶病毒(PenMV)的检测试纸条,其检测灵敏度分别为100ng/ml和200ng/ml,其都能达到实际应用的效果。
本实验也研究了烟草叶片中不同的成分,如DNA、RNA、叶绿素等对试纸条灵敏度的影响。结果表明烟草叶片中的成分对试纸条的检测下限没有影响;但极端bH值对试纸条的检测灵敏度有很大影响。
该试纸条最大的优点在于无需借助实验室的设备,只需要取少量的植物汁液滴在试纸条上的样品垫上,便可以在十五分钟内得到检测结果,适合对一些检疫性植物病毒当场、即时地进行检测。