过表达Rip2对人胰腺癌细胞Panc-1凋亡的影响

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目的:  观察过表达Rip2对人胰腺癌细胞Panc-1凋亡的影响及其作用机制。  方法:  本实验利用 JetPRIME阳离子聚合物转染法分别将 pEGFP-C2空质粒和pEGFP-Rip2重组质粒转染入人胰腺癌Panc-1细胞。实验分3组,分别为对照组(control),转染pEGFP-C2空质粒组和转染pEGFP-Rip2重组质粒组,转染后培养细胞48 h。采用Hochest33342染色法、Annexin V-PE/7-AAD染色流式细胞术检测各组凋亡情况;荧光法及比色法分别检测细胞 caspase-8、caspase-9和caspase-3的活性;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达;DASPEI染色法检测细胞线粒体膜电位的变化。  结果:  (1)转染 pEGFP-C2空质粒组和 pEGFP-Rip2质粒组细胞在荧光显微镜下可见明显绿色荧光蛋白表达;并且转染 pEGFP-Rip2质粒组 Rip2细胞蛋白表达显著高于对照组和pEGFP-C2组,而对照组与pEGFP-C2组相比细胞Rip2蛋白表达差异无统计学意义。(2)Hoechst33342染色结果显示,与对照组和pEGFP-C2组比较,荧光显微镜下观察到pEGFP-Rip2组有较多的细胞核呈强蓝色深染。(3)流式细胞术检测表明,pEGFP-Rip2组细胞凋亡率明显高于对照组和 pEGFP-C2组,而对照组与 pEGFP-C2组比较细胞凋亡率无显著差异。(4)与对照组和pEGFP-C2组比较。pEGFP-Rip2组细胞Fas、 Bax、胞浆Cyt-c和细胞P53凋亡相关蛋白表达显著增高,而 Bcl-2蛋白表达则明显降低。(5)pEGFP-Rip2组细胞线粒体膜电位明显低于对照组和pEGFP-C2组。(6)pEGFP-Rip2组与对照组和pEGFP-Rip2组相比,细胞caspase-8、9和3活性显著增高。  结论:  1. pEGFP-Rip2重组质粒转染 Panc-1细胞后 Rip2蛋白表达明显升高,说明pEGFP-Rip2质粒成功转入细胞。  2.过表达Rip2可增加caspase-3活性,诱导细胞凋亡。  3.过表达Rip2可显著增加细胞P53蛋白的表达;  4.过表达Rip2可上调细胞Bax以及胞浆Cyt-c蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达;并明显降低细胞线粒体膜电位;增加caspase-9活性,从而激活内源性凋亡途径;  5.过表达Rip2可上调细胞Fas蛋白表达,增加caspase-8活性,从而激活外源性凋亡途径;  根据以上结果可得出结论:过表达 Rip2能诱导人胰腺癌细胞 Panc-1凋亡,其作用机制可能与其激活内、外源性凋亡途径相关。
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