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1猪LSM14A基因抑制PRRSV复制的功能研究猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS),又称猪蓝耳病,是一种全球性的病毒性传染性疾病,主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起。PRRSV是一种单股正链的RNA病毒,主要造成仔猪高死亡率、各年龄阶段猪的呼吸道病症,以及妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等危害,给养猪业造成极大的损失。模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)通常包括质膜定位的Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs),胞质定位的RIG-I样受体(RIG-I-like receptors, RLRs)和NOD样受体(NOD-like receptors, NLRs)等,在先天免疫反应中通过识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)发挥着重要的作用。LSM14A作为一种新型胞质病毒核酸受体,可以直接识别并结合病毒核酸,包括RNA和DNA,继而通过与RIG-I或VISA相互作用,介导Ⅰ型干扰素(Interferons, IFNs)的表达。过表达LSMI4A可以有效抑制水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)和新城疫病毒(Newcastle Disease virus, NDV)在293细胞中的复制,但是过表达LSM14A基因是否对PRRSV复制产生影响尚未见报道。因此,本研究以新型病毒核酸受体LSM14A作为抗病候选基因,在非洲绿猴肾细胞(Marc-145 cells)和猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages, PAMs)中进行相关的功能研究,以期解析该基因在PRRSV复制过程中的作用。得到如下结果：(1)成功克隆了通城猪LSM14A、IFI6、IFI16、PPBP、ZDHHC9和CLU基因,分别构建了真核过表达载体pRK-Flag-LSM14A、pRK-Flag-IF16、pRK-Flag-IFI16、 pRK-Flag-PPBP、pRK-Flag-ZDHHC9和1pRK-Flag-CLU,在Marc-145细胞中通过过表达实验研究这些基因对PRRSV复制的影响,结果发现过表达LSM14A基因可以显著抑制病毒复制。(2)在Marc-145细胞中通过过表达及干扰,采用定量PCR、免疫荧光和空斑实验发现LSM14A基因可以抑制]PRRSV复制,并且采用干扰回复实验证实了干扰片段的特异性及有效性。同时采用体外重组的方法构建了腺病毒Ad5-LSM14A,通过腺病毒感染的方法在PAMs中过表达了LSM14A基因,在PAMs中研究了该过表达基因对PRRSV复制的影响,结合在PAMs中干扰LSM14A基因实验说明LSM14A在PAMs中可以抑制PRRSV复制。(3)在Marc-145细胞中通过双荧光素酶报告基因实验发现过表达LSM14A基因可以激活IFN-β和ISRE的启动子活性,PRRSV感染可以协同LSM14A基因促进IFN-β和ISRE启动子活性的激活。同时过表达LSM14A基因后,IFN-β:和RIG-I基因表达量分别被上调,一些典型的干扰素诱导基因(IFN-stimulated genes, ISGs)包括IFITMs、 IFITs和PAS1的表达量也都被显著的上调。结合启动子的数据说明,在Marc-145细胞中过表达LSM14A可以激活IFN-β抗病毒信号通路,从而抑制PRRSV的复制。(4)在Marc-145细胞中过表达LSM14A基因后,促炎因子IL-6、TNF-α基因表达被抑制,说明在Marc-145细胞中,免疫系统通过激活干扰素抗病毒通路同时抑制过度炎症反应,达到抑制病毒复制的效果。(5)定量PCR检测了PRRSV感染7天后的通城猪及大白猪PAMs、脾、肺、淋巴细胞及组织样中LSM14A基因的相对表达量,发现通城猪和大白猪感染PRRSV后LSM14A基因的表达被抑制。2 G4基因激活NF-κB的功能研究主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)又称白细胞抗原复合体(Leukocyte Antigen complex, LA complex),经典的分类方法将MHC分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个区,主要参与机体免疫反应,与多种疾病存在一定的相关性。近年研究发现MHC Ⅲ区中靠近端粒的一侧富含涉及炎症反应的基因,例如TNF超家族成员等,因而Gruen和Weissman将这一区域命名为MHC-Ⅳ区。MHC-Ⅳ区G4是其中研究较少的新基因之一,它位于Hsp70与AIF-1、TNF之间,与成纤维细胞生长因子受体3(Fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)存在互作,同时人G4基因在关节炎患者单核细胞中的表达水平显著低于正常对照组,说明G4与炎症反应有着一定的联系。核转录因子NF-κB在机体炎症反应进程中发挥着重要的生物学作用,因此本研究从MHC-Ⅳ区的新基因和课题组前期G4基因的研究结果出发,探索G4基因在NF-κB信号通路中扮演的角色,并从细胞和个体水平分析G4蛋白的定位特征,继而进一步解析G4基因与炎症反应的关系。得到了如下结果：(1)G4是MHC-Ⅳ中激活NF-κB的一个重要基因。本研究从MHC-Ⅳ中筛选了7个功能尚不清楚基因,包括ABHD16A、G4(C6orf47)、C6orf48、GPANK1、MCCD1、SAPCD1和ZBTB12,研究这些基因是否参与NF-κB信号通路的激活,结果显示这7个新基因中仅G4可以显著激活NF-κB,其他基因不参与NF-κB信号通路的激活。同时我们又从蛋白水平做了验证,共转染G4与p65后免疫荧光结果显示p65蛋白由细胞质进入细胞核,提示此时NF-κB信号通路被激活,进入细胞核发挥转录调节作用。(2)在BHK21细胞中进行的免疫荧光实验发现G4蛋白过表达后有细胞膜定位趋势,并且和早期内涵体存在部分共定位。利用小鼠组织样进行的免疫组化实验发现内源G4蛋白主要分布于膀胱和肺上皮细胞,同时内源性G4蛋白在小鼠膀胱上皮细胞中存在细胞质膜分布的现象,但是没有发现G4蛋白在大脑、小脑、小肠及肝脏中存在分布。(3)G4基因激活NF-κB依赖IκB激酶复合物(Nuclear factor kappa-B kinase, IKK)复合物而非转化生长因子p激活激酶1(TGF-beta-activated kinase 1, TAK1)复合物。IKK复合物处于NF-κB信号通路的中下游,IKK复合物抑制剂PS1145可以显著抑制过表达G4基因对NF-κB信号通路,表明G4基因激活NF-κB信号通路的位置在IKK复合物的上游；TAK1复合物处于NF-κB信号通路的上游,TAK1复合物抑制剂5Z-7-oxozeaeno1、TAK1显性失活突变体TAK1(K63W),都不能影响G4基因激活NF-κB信号通路的能力,表明G4基因激活NF-κB信号通路发生在TAK1复合物的下游。即G4基因激活NF-κB的途径发生在IKK复合物的上游TAK1复合物的下游。