目的:在实验室前期课题研究基础上,以影响IPF进程的关键细胞AM亚群M1、M2的极化趋向为线索,系统回顾升降浮沉药性理论历史源流及临床应用,分析麻黄、五味子对M1/M2极化调节的差异及其机理,尝试从“AM/TGF-β1/Smad”信号通路角度阐释升降浮沉药性指导IPF治疗的科学意义。方法:(1)文献回顾:系统查阅升降浮沉药性理论相关的古籍与文献,梳理升降浮沉药性理论的历史源流、理论研究及临床研究,检索CNKI、VIP数据库、万方数据库、Pubmed及中国生物医学文献数据库近十年文献,总结巨噬细胞极化在肺纤维化中的作用,梳理TGF-β31/Smad信号通路对不同疾病的调控作用。(2)体内实验:将120只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、麻黄组、五味子组及Dex组,除假手术组外,各组均采用博莱霉素气管滴入法复制IPF模型,假手术组同样方法滴注生理盐水,分别于造模后7d、14d和28d取肺组织,HE染色观察大鼠肺组织病理形态,免疫组化法染色观察CD163和iNOS在肺组织中的表达。(3)体外实验:15只SPF级Wistar雄性大鼠分别用麻黄水煎液、五味子水煎液灌胃7d,7d后取血获得含药血清;将30只SPF级Wistar雄性大鼠通过肺泡灌洗的方法获取AM,分别用麻黄含药血清、五味子含药血清和空白血清培养AM,48小时后向板内加入MTT及DMSO,用MTT法检测含药血清对细胞活性的影响;将AM用含药血清培养48h后,采用流式细胞术检测麻黄、五味子的含药血清对AM向M1、M2极化趋向的影响;AM用含药血清培养48h,应用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-αTGF-β1的表达情况,采用WestenBlot方法检测麻黄、五味子的含药血清对M1、M2细胞内NF-κB、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达的影响,采用RT-PCR法进行实时荧光定量PC.R检测,测定细胞内NF-κB、Smad3、Smad4、Smad7mRNA表达差异。结果:(1)体内实验:①在博来霉素诱导的肺纤维化模型中,与假手术组大鼠比较,模型组大鼠呼吸频率明显升高,具有显著性差异(P<0.01);麻黄、五味子均可降低IPF大鼠的呼吸频率,与模型组比较具有统计学差异(P<0.05),其中麻黄在造模后7天时降低明显,五味子在造模后28天时较麻黄组降低更明显。HE染色结果表明,假手术组大鼠的肺泡结构比较完整,未出现融合、炎性浸润现象,肺泡间隔未见增厚,未见纤维形成。7d时,模型组大鼠的肺泡腔内出现大量炎性细胞浸润,部分肺泡腔融合、破损,部分肺泡间质增厚,但未见明显的纤维束形成;麻黄、五味子水煎液组的大鼠肺泡结构均存在不同程度的肺泡腔融合与破损,肺泡内存在少量炎性细胞浸润,但其程度和范围与模型组相比均较轻。14d时,模型组大鼠支气管周围散在纤维束,肺泡破损形成肺大泡,麻黄组和五味子组肺泡出现一定程度破损,出现少量纤维束,但轻于模型组。28d时,模型组肺组织出现大量的纤维束聚集,且支气管周围更甚,肺泡结构紊乱,肺泡壁破损,出现肺大泡,炎性浸润较7天时有所减轻;麻黄、五味子水煎液组大鼠的肺组织均出现不同程度的肺泡壁破损,间隔增厚,有纤维束形成,但其程度较之模型组较轻。与模型组的病理形态分级比较,麻黄组与五味子组可改善大鼠肺纤维化病理形态,差异具有统计学意义(P<0.05)。②在免疫组化染色观察中,模型组大鼠iNOS表达显著上升,与假手术组比较具有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,麻黄、五味子均能抑制iNOS的表达(P<0.01),且麻黄抑制效果明显强于五味子,在14d、28d时麻黄、五味子组二者组间比较具有显著性差异(P<0.01);同时,麻黄、五味子均可明显抑制CD163表达,与模型组比较均有显著性差异(P<0.01);且五味子抑制效果明显强于麻黄,在7d、28d时麻黄、五味子组二者组间比较具有显著性差异(P<0.01)。(2)体外实验:①在麻黄、五味子含药血清对细胞毒性影响实验中,麻黄、五味子含药血清终浓度为10%时,细胞生长状况较其他浓度条件下稳定。②麻黄、五味子含药血清体外诱导大鼠肺泡巨噬细胞M/M2极化实验中,LPS+IFN-γγ组M1型巨噬细胞明显增多,与空白组比较,具有显著性差异(P<0.01);IL-4组M2型巨噬细胞数量显著上升,与空白组比较,具有显著性差异(P<0.01);麻黄组M2型巨噬细胞比例与IL-4组比较明显降低,具有显著性差异(P<0.01),M1型巨噬细胞明显降低,与LPS+IFN-γ组比较,具有显著性差异(P<0.01);五味子组M2型巨噬细胞数量明显减少,与IL-4组相比具有显著性差异(P<0.01),与LPS+IFN-γ组比较,其M1型巨噬细胞数量下降,具有显著性差异(P<0.01)。③麻黄、五味子含药血清影响M1、M2 释放 TNF-α、TGF-β1 实验中,阳性对照组 LPS+IFN-y组、IL-4 组的 TNF-α、TGF-β1含量与其他组相比也呈上升趋势,与空白组比较,具有显著性差异(P<0.01),与LPS+IFN-y组、IL-4组比较,麻黄组和五味子组的TNF-α及TGF-β1含量均明显下降,具有显著性差异(P<0.01),但都高于空白组,与空白组比较,具有显著性差异(P<0.01);④麻黄、五味子含药血清影响M1、M2中NF-κB、Smad3、Smad4、Smad7实验中,麻黄组、五味子组均能抑制NF-κκB、Smad3和Smad4的表达,与空白组比较具有统计学差异或显著性差异(P<0.05或P<0.01),上调Smad7的表达,且与空白组比较具有显著性差异(P<0.01)。⑤麻黄、五味子含药血清影响M1、M2中NF-κB、Smad3、Smad4、Smad7mRNA实验中.麻黄组、五味子组都能抑制NF-KBmRNA的表达,抑制Sm,ad3及Smad4mRNA表达,与空白组比较具有统计学差异或显著性差异(P<0.05或P<0.01),同时麻黄组、五味子组上调Smad7mRNA表达.与空白组比较具有显著性差异(P<0.01)。结论:本研究以“AM/TGF-ββ1/Smad”信号通路为线索,分别从体内、体外实验两方面探究麻黄、五味子对AM极化趋向的差异及其作用机理。研究结果表明,肺纤维化过程中伴随着肺泡结构破损、融合,间质增厚,纤维束增生等情况,在肺泡炎阶段,AM为IPF的重要调控细胞.同时为该信号通路的细胞靶点,麻黄、五味子可抑制iNOS分泌而抑制M1极化,降低炎性因子分泌,减少肺泡破损,抑制炎性细胞浸润,进而抑制肺泡炎发展,且麻黄抑制效果明显强于五味子;纤维化阶段,麻黄、五味子可抑制CD163形成而抑制M2过度极化,且五味子抑制效果更显著,减少纤维束的形成而抑制肺纤维化进程。这与前期研究结果麻黄在早期肺泡炎阶段作用更显著,五味子在晚期肺纤维化阶段作用更显著相吻合。继而通过体外实验从“AM/TGF-β1/Smad”角度探究该种差异的作用机理,体外结果表明,麻黄、五味子均可抑制AM向M1、M2亚型极化,且麻黄抑制AM向M1亚型极化作用强于五味子,五味子抑制AM向M2亚型极化效果优于麻黄,深入研究发现,在对M1亚型的抑制中,麻黄、五味子可能是通过抑制炎性因子TNF-α的分泌,减少TNF-α对NF-κB的刺激而将其激活,同时二药可抑制NF-κBmRNA的表达进而抑制NF-κB的产生,因而阻断NF-κB与STAT信号通路的作用而抑制M1极化的信号传导途径,抑制AM向M1亚型极化而抑制炎症反应,且该过程麻黄抑制效果较强。在对M2亚型的抑制中,TGF-β1作为信号通路的启动因子,Smad蛋白为信号转导过程中的关键受体,麻黄、五味子可能通过抑制TGF-β1的分泌而抑制其TβRI型受体激活,通过下调Smad3、Smad4mRNA的表达而抑制Smad3、Smad4的表达,对Smad3、Smad4表达的抑制作用减少了 Smad3与TβRI型受体结合成二聚体,抑制的二聚体的磷酸化及后来与Smad4结合成寡聚体,阻断了 TGF-β1信号的传导途径;同时,麻黄、五味子促进Smad7表达,Smad7与Smad3竞争性结合TβRI型受体抑制了 Smad3的磷酸化,进而干扰Smmad3和Smad4的结合而发挥负调控作用,抑制TGF-β1信号向胞内传导,且该过程五味子抑制作用更显著。作为TGF-β1/Smad信号通路的启动因子,抑制TGF-β1分泌减少了TGF-β1信号的产生,且该通路的关键受体Smad3、Smad4蛋白表达被抑制,具有负调控作用的Smad7蛋白表达增强,TGF-β1传导通路受阻导致其信号不能及时进核转录,从而抑制AM向M2亚型极化。本次研究以“AM/TGF-β1/Smad”信号通路为导向,以麻黄、五味子为代表药,通过探究具有典型升降特性的中药对AM极化的作用趋向,初步得出在IPF中升浮药可能在肺泡炎阶段抑制AM向M1亚型极化明显,沉降药可能在纤维化阶段抑制AM向M2亚型极化明显。本次研究同时也从分析生物学角度对前期研究结果麻黄在早期肺泡炎阶段作用更显著,五味子在晚期肺纤维化阶段作用更显著进行了更深层次的阐释,为升降浮沉药性的分子生物学研究提供有益探索。