第一部分:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是最早被发现的对虾病原弧菌,也是危害最严重的病原之一。研究证明V.parahaemolyticus是近年来全球性暴发疾病对虾急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)的主要病原。本研究对实验室2013-2016年分离自我国沿海地区发病养殖场对虾体内的细菌进行分析,鉴定出V.parahaemolyticus 151株,按地域分类,分离自河北省34株,天津市13株,山东省21株,江苏省7株,浙江省29株,广东省18株,广西省24株,海南省5株;按感染宿主分类,分离自中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)3株,日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)7株,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)141株。对其进行AHPND的相关毒力蛋白基因pir AVP和pir BVP检测,阳性检出率为33.11%。血清分型研究结果表明,151株虾源V.parahaemolyticus中,有149株可以鉴定出O抗原血清型,其鉴定率为98.68%,其中以O1,O8,O3,O2为主;有62株可以鉴定出K抗原血清型,其鉴定率仅为41.06%,且型别较为分散,除K25群较多(22.58%)外无明显趋势;有60株可以同时被O和K两种抗原血清型分型,完全分型率为39.74%,形成24个O:K血清组合,出现最多的是O1:K25,占23.33%(14/60),其余型别较为分散,无明显优势组合,且没有出现O3:K6人类“大流行菌群”菌株。药物敏感性分析结果显示:151株虾源V.parahaemolyticus对哌拉西林、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦以及奈替米星这6种药物完全敏感,对其余14种药物表现出了不同程度的耐药性,其中对替卡西林、头孢噻吩具有最广泛的耐药性,其耐药率分别为53.64%和39.74%,对阿莫西林、头孢呋辛和复方新诺明的耐药也较为严重。多重耐药现象十分突出,有84株(55.63%)V.parahaemolyticus对2种以上药物表现出耐药性,34株(22.52%)对3种以上药物表现出耐药性,10株(6.62%)对4种以上的药物存在耐药性,2株同时对8种药物存在耐药性。此外,V.parahaemolyticus耐药性还存在明显的地区差异。第二部分:AHPND是当前严重危害对虾产业的流行疫病,自2010年首次报道以来,已对全球对虾养殖造成了极大的损失。已报道凡纳滨对虾和斑节对虾是AHPND的易感品种,中国明对虾对该病的易感性尚不清楚。菌株20140723005分离自疑似患AHPND的中国明对虾体内,通过急性浸泡感染实验研究该菌对中国明对虾的致病性。结果发现,感染后3 h对虾不再摄食,6 h肠胃变空,9 h肝胰腺呈浅白色。感染后10 h感染组中国明对虾开始出现死亡,12 h大量死亡,18 h内累积死亡率达100%。组织病理研究发现,感染组对虾肝胰腺小管变薄、崩塌,上皮细胞严重脱落,呈现典型的AHPND病理特征。经16S r RNA和分子伴侣蛋白gro EL基因序列分析,结合细菌生理生化特征以及致病基因的PCR检测,鉴定该菌为V.parahaemolyticus,且携带AHPND的相关毒力蛋白基因pir AVP和pir BVP,但不携带耐热直接溶血毒素(Thenmostable Direct Hemolysin,tdh)和相对耐热直接溶血毒素(TDH-Related Hemolysin,trh)毒力基因。该分离菌的血清型被鉴定为O3:K31。药敏试验显示,该菌对头孢噻吩、头孢呋辛表现为耐药,对阿莫西林、庆大霉素、环丙沙星等19种药物敏感。本研究证实中国明对虾也可以被副溶血弧菌感染而罹患AHPND,是该病的易感品种。第三部分:2016年3月山东潍坊某凡纳滨对虾养殖场下塘38天虾苗(2~4 cm)出现大规模急性死亡。发病虾表现为空肠空胃,肝胰腺颜色变浅或发白,伴有肌肉轻微浑浊等症状,与AHPND临床特征相似。本研究从患病的凡纳滨对虾肝胰腺中分离得到一株优势菌,编号为20160303005-1。人工感染实验表明,该菌对凡纳滨对虾具有较强的致病性,浸泡感染的半数致死剂量(LD50)为7.96×103 CFU/ml。对虾急性感染后,6 h肝胰腺颜色变浅,肠胃变空;9 h肝胰腺呈浅白色,萎缩变小,死亡数过半;24 h感染组对虾全部死亡。组织病理学分析显示,感染组对虾的鳃、肝胰腺和肠出现不同程度的病理损伤,其中肝胰腺小管崩塌,上皮细胞严重脱落,呈现出典型的AHPND病理症状。通过16S r RNA和分子伴侣蛋白gro EL基因序列分析,并结合生理生化特征,将该细菌鉴定为V.parahaemolyticus,其血清型为O1:KUT(K untypeable)。该菌株携带可引起对虾AHPND的相关毒力蛋白基因pir AVP和pir BVP,但不携带tdh和trh基因。菌株药敏试验结果显示,该菌对庆大霉素、环丙沙星和头孢他啶等16种药物敏感,对阿莫西林、替卡西林和头孢噻吩等5种药物表现为耐药。第四部分:2015年11月广西北海某日本囊对虾养殖场下塘90余天的日本囊对虾(5~6 cm)出现大量不明原因死亡。从pir AVP和pir BVP基因PCR检测结果呈阳性的病虾肝胰腺组织中,分离得到一株优势菌20151116002-3。另外,从河北沧州某养殖场AHPND病原弧菌检测结果呈阳性的日本囊对虾样品中,分离到菌株20140722001-1。通过急性浸泡感染实验研究这两株菌对日本囊对虾的致病性,20151116002-3感染组9 h后对虾体色变浅,肝胰腺颜色变浅,开始出现死亡,30 h后对虾死亡数过半,72 h后对虾死亡率达到100%。而20140722001-1感染组30 h后对虾开始出现死亡,肝胰腺呈浅白色,明显萎缩,96 h后对虾死亡率达到100%。组织病理研究发现,20151116002-3感染对虾的肝胰腺小管崩塌,上皮细胞严重脱落,与AHPND病理特征一致。20140722001-1感染对虾的肝胰腺小管上皮细胞大部分已变性坏死,整体消溶,肝胰腺小管结构出现崩解,成为一个大空泡,没有体现出AHPND的典型特征。菌株20140722001-1能导致日本囊对虾患病致死,但是否为AHPND还有待进一步研究。经鉴定菌株20151116002-3和20140722001-1均为携带编码毒力蛋白pir AVP和pir BVP基因的V.parahaemolyticus,但不携带临床菌株毒力基因tdh和trh,其血清型分别为O1:KUT和O3:K31。药敏试验显示,菌株20151116002-3对替卡西林、头孢噻吩、头孢西丁3种药物表现为耐药,而菌株20140722001-1只对头孢噻吩表现为耐药,对阿莫西林、庆大霉素等20种药物敏感。