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研究背景糖尿病性心肌病（diabeticcardiomyopathy,DCM）是指发生于糖尿病患者,不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他心脏病变来解释的心肌结构和功能障碍。DCM是糖尿病患者心力衰竭（heart failure,HF）发病率和死亡率高的主要原因,但目前仍然缺乏针对DCM的有效治疗方法。因此,进一步研究DCM发生发展的确切机制至关重要。MicroRNAs（miRNAs）是一类在进化上高度保守的内源性单链小RNA,其主要功能是通过与靶标mRNA的3’UTR区域结合,并随后诱导其降解或抑制翻译,以负调控靶基因的表达。最近,miRNAs已成为糖尿病及其并发症诊断、治疗和预后的潜在生物标志物,然而其在DCM心肌纤维化中发挥何种作用和具体作用机制尚不明确。本研究通过对芯片数据进行生物信息学分析,筛选出多个差异表达miRNAs,其中miR-543与胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）和糖尿病关联密切。由于胰岛素抵抗在DCM心肌纤维化发生和发展中的关键作用,miR-543可能是架起胰岛素抵抗、心肌纤维化和DCM的桥梁。本研究检测了 DCM小鼠心肌组织和胰岛素抵抗心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）中miR-543表达情况,并研究miR-543对DCM心肌纤维化的作用及其可能的机制。研究目的（1）检测miR-543在DCM小鼠心肌组织中的表达情况,探究其与DCM心肌纤维化的相关性。（2）探讨miR-543在胰岛素抵抗CFs中的表达情况,及其在CFs表型转化和胶原表达中的可能作用。（3）研究miR-543在DCM心肌纤维化中的作用机制。研究方法（1）采用R软件进行芯片数据差异表达分析。（2）联合应用高脂饮食诱导和链脲佐菌素建立2型糖尿病小鼠模型。（3）应用超声心动图监测小鼠心功能。（4）采用HE染色、Masson染色、免疫组织化学染色检测小鼠心肌纤维化水平。（5）采用RT-PCR检测miR-543表达水平。（6）联合应用高糖和高胰岛素建立胰岛素抵抗CFs模型。（7）联合应用 RT-PCR 和 Western blot 检测 PTEN、α-SMA、Collagen I和 Collagen Ⅲ的表达水平。（8）采用EdU试剂盒检测CFs增殖水平。（9）联合应用transwell和划痕实验检测CFs迁移水平。（10）采用双荧光素酶报告基因验证miR-543与PTEN的靶向关系。研究结果（1）差异表达miRNAs分析通过对芯片GSE17035的8个样本进行生信分析得到36个上调miRNAs,22个下调miRNAs。查阅文献发现上调miRNAs中miR-543与糖尿病和胰岛素抵抗均相关,因此选择miR-543作为研究目标。（2）DCM小鼠模型的建立与对照组相比,糖尿病组小鼠左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd）和 E/E’均明显增加,左室射血分数（leftventricularejectionfraction,LVEF）及左室缩短率（fractional shortening,FS）均明显降低,提示成功建立DCM小鼠模型。（3）DCM小鼠心肌纤维化程度增加与对照组相比,DCM组小鼠心肌组织胶原容积分数（collagen volume fraction,CVF）明显增加,同时Collagen Ⅰ和CollagenⅢ的蛋白表达水平也明显增加。（4）DCM小鼠心肌组织miR-543表达水平增加与对照组相比,DCM组小鼠心肌组织miR-543表达水平增加。（5）心肌纤维化程度与心肌组织miR-543表达水平呈正相关小鼠心肌组织胶原容积分数与miR-543表达水平呈正相关（P＜0.01）;小鼠心肌组织Collagen Ⅰ蛋白表达水平与miR-543表达水平呈正相关（P＜0.01）。（6）原代心肌成纤维细胞鉴定细胞在形态上呈梭形,细胞大小均匀,无自发性搏动,vimentin荧光染色阳性。（7）胰岛素抵抗CFs模型的建立高糖和高胰岛素联合应用建立胰岛素抵抗CFs模型,结果显示IRS-1/AKT信号通路受损、Glut4膜转位减少,提示成功建立胰岛素抵抗CFs模型。（8）胰岛素抵抗心肌成纤维细胞miR-543表达水平增加心肌成纤维细胞miR-543表达水平在胰岛素抵抗刺激48 h时最高,将胰岛素抵抗刺激48 h作为后续诱导胰岛素抵抗CFs模型的实验条件。（9）MiR-543 inhibitor 明显抑制 miR-543 表达水平与对照组相比,miR-543 inhibitor组miR-543表达水平明显降低。（10）抑制miR-543表达可减少胰岛素抵抗CFs的增殖与对照组相比,胰岛素抵抗组CFs的增殖水平明显增高,而miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后,胰岛素抵抗组CFs的增殖水平明显降低。（11）抑制miR-543表达可减少胰岛素抵抗CFs的迁移与对照组相比,胰岛素抵抗组CFs的迁移水平明显增高,而miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后,胰岛素抵抗组CFs的迁移水平明显降低。（12）抑制miR-543表达可减少胰岛素抵抗CFs向肌成纤维细胞的转化和胶原表达与对照组相比,胰岛素抵抗组CFs α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,而miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后上述指标表达水平均明显降低。（13）MiR-543靶基因的筛选用 TargetScan、miRDB、miRWalk、microT 四个网站和 starbase 数据库中的 PITA、miRanda、miRmap取交集得到14个预测靶基因。其中PTEN与纤维化联系密切,因此PTEN可能介导了 miR-543的促纤维化作用。（14）PTEN在DCM小鼠心肌组织和胰岛素抵抗CFs中表达水平降低与对照组相比,DCM组心肌组织PTEN mRNA和蛋白表达水平均明显降低。与对照组相比,胰岛素抵抗组CFs PTEN mRNA和蛋白表达水平均明显降低。（15）PTEN 是 miR-543 靶基因与对照组相比,miR-543 mimic组降低WT-PTEN的荧光素酶活性,但对MUT-PTEN的荧光素酶活性无明显影响。与胰岛素抵抗组相比,miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后PTEN mRNA和蛋白表达水平均升高。以上结果说明PTEN是miR-543靶基因。（16）SiPTEN明显下调PTEN表达与对照组相比,3种siPTEN均明显降低PTEN mRNA和蛋白表达水平。（17）MiR-543通过靶向PTEN调控CFs增殖与胰岛素抵抗组相比,miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后,CFs的增殖水平明显降低。与 IR+miR-543 inhibitor组相比,IR+miR-543 inhibitor+siPTEN 组 CFs 的增殖水平明显升高。（18）MiR-543通过靶向PTEN调控CFs迁移与胰岛素抵抗组相比,miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后,CFs的迁移水平明显降低。与 IR+miR-543 inhibitor 组相比,IR+miR-543 inhibitor+siPTEN 组 CFs 的迁移水平明显升高。（19）MiR-543通过靶向PTEN调控CFs向肌成纤维细胞的转化和胶原表达与胰岛素抵抗组相比,miR-543 inhibitor抑制miR-543表达后,CFs的α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 mRNA 和蛋白表达水平均明显降低。与 IR+miR-543 inhibitor组相比,IR+miR-543 inhibitor+siPTEN组CFs上述指标表达水平均明显升高。研究结论（1）糖尿病性心肌病小鼠心肌纤维化程度增加,伴随miR-543表达上调。（2）抑制miR-543表达可减少胰岛素抵抗状态下的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和胶原表达。（3）MiR-543通过靶向PTEN介导其在胰岛素抵抗状态下的心肌成纤维向肌成纤维细胞转化和胶原表达中的作用。