高效、安全、稳定的基因递送载体的研究是目前基因治疗研究的难点,也是热点。与病毒基因递送载体相比,非病毒基因递送载体具有低毒、易于合成、免疫反应低、可靶向性修饰等特点,因此备受国内外研究者的关注。但阳离子聚合物载体迄今为止仍未能进入临床应用,还存在诸多问题亟待解决。尤其是静脉给药后在体循环中的稳定性差,转染效率普遍较低。因而迫切需要研究高效、低毒、靶向、安全而且可以真正应用于体内基因转染的非病毒基因递送系统。本课题通过药剂学、高分子材料学和分子生物学等技术手段的交叉应用,结合聚(β-氨基酯)(Poly (β-amino ester),PbAE)和羧甲基聚(L-组氨酸)(Carboxymethyl poly (L-histidine),CM-PLH)两种材料自身的特点,构建了一种基于静电包衣的自组装CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物载体系统用于基因递送的研究。该载体系统是以阳离子聚合物PbAE为基础载体材料,凭借分子中的多氨基而带正电,能够有效自组装压缩带负电荷质粒DNA,形成PbAE/DNA二元复合物纳米粒。进一步通过CM-PLH静电包衣对纳米粒进行修饰,形成核-壳式的CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物纳米粒载体系统。该载体系统具有以下特点：(1)CM-PLH荷负电,CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物表面的正电荷比PbAE/DNA二元复合物低,从而可以降低阳离子聚合物材料因强烈的正电性所引发的细胞毒性；(2)利用高分子之间产生的较强的静电作用力,延长载体系统在体内的循环时间,长时间保持载体系统在体内的稳定性；(3)CM-PLH分子中含有大量的咪唑基团,对pH敏感,复合物进入细胞后可发生“质子海绵作用”冲破溶酶体屏障,保护质粒不被酶降解,从而可以提高转染效率。(4)避免功能基团与载体材料化学反应而影响载体与DNA结合、降低转染效率。本文研究内容包括PbAE的合成、表征与筛选；PbAE/DNA二元复合物的制备、表征及条件优化；CM-PLH的合成与表征；CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物载体系统的构建并选用人胚胎肾细胞HEK293以及黑色素瘤细胞B16F10对处方进行筛选,并将最终确定最优处方;将最优处方的三元复合物载体系统应用于报告基因pEGFP-N2和治疗基因pTNFSF10-EGFP递送的研究中；采用加入特异性抑制剂的方法,考察复合物的细胞内吞途径和转运机制；采用激光共聚焦技术观察复合物进入细胞以及细胞内转运的过程；建立黑色素皮下肿瘤模型和肺转移肿瘤模型,考察三元复合物载体系统在体内的基因转染。本课题首先合成了不同末端基团封端的阳离子聚合物PbAE,并通过结构表征、体外安全性评价和转染效率等方面对不同的PbAE进行筛选,最终确定将胺单体与酯单体合成摩尔比为1.2：1时的PbAE用于后续的研究中。采用静电凝聚法(coacervation)制备PbAE/DNA二元复合物并对处方进行初步优化,当质量比为50：1可制备得到平均粒径在150nm左右的复合物纳米粒,体外转染效率与Lipofectamine2000相当。三元复合物是由PbAE、CM-PLH和质粒DNA三种成分组成。首先对聚(L-组氨酸)进行羧甲基化,合成CM-PLH,采用静电凝聚法对PbAE/DNA二元复合物进行静电包衣,制备CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物载体系统。对载体系统的性质进行了考察,包括粒径和zeta电位,其压缩包裹质粒DNA的能力、抗DNase I的酶解、抗肝素钠解离和血清解离的能力。结果显示,在实验范围内PbAE可完全压缩质粒DNA,抑制DNA的电泳行为；加入CM-PLH后并不影响复合物的稳定性,并且可完全阻止浓度为0.4U/μg DNA的DNase I的降解作用；载体材料能够保护质粒DNA不受血清的解离作用,即使血清的浓度高至50%；复合物能否抗肝素钠的解离作用则与肝素钠的浓度密切相关,当肝素钠浓度在选取的浓度范围内,复合物基本没有解离。静电包衣后,随着CM-PLH量的增加,CM-PLH/PbAE/DNA复合物的细胞毒性逐渐降低。细胞摄取行为呈时间依赖性。采用荧光显微镜定性和细胞流式仪定量测定表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数,以阳性细胞百分率为指标,比较了CM-PLH的加入量对HEK293细胞和B16F10细胞转染能力的差异,结果显示加入CM-PLH后的转染效率远远强于二元复合物。筛选出的复合物最优处方质量比为10：50：1。这一比例既能保证该复合物载体系统具有足够的正电荷,又不至于有太大的细胞毒性,加上咪唑基团的“质子海绵”作用,使得复合物无论在粒径大小、正电势的高低还是细胞毒性和转染效率方面都达到了最优化,基本上符合实验的设计要求。进一步研究表明,该三元复合物的转染效率具有细胞依赖性,摄取时间依赖性和一定的血清耐受性。本课题又成功地将构建好的三元复合物载体系统用于治疗基因质粒pTNFSF10-EGFP的递送研究中。以EGFP为指标,通过流式细胞仪可间接定量治疗基因pTNFSF10-EGFP的转染效率,并进一步从分子生物学的角度,采用荧光定量PCR对治疗基因所表达的TRAIL进行定量分析。结果表明,我们所构建的三元复合物载体系统在两种肿瘤细胞Hela和MCF7中对治疗基因的转染PCR相对定量明显优于阳性对照Lipofectamine2000, TRAIL蛋白的表达量是阳性对照的1.5倍。Western印迹分析可知,TRAIL活化凋亡信号通路蛋白Caspase-8的表达量上调以及抗凋亡因子BCL-2的表达量下降。这就证明TRAIL是通过胞外或胞质通路和胞内或线粒体通路两种通路调控促进肿瘤细胞的凋亡。选择载体系统最优处方,以B16F10为模型细胞,采用加入细胞摄取特异性抑制剂的方法,考察三元复合物进入细胞的内吞途径以及这些内吞是否能够导致有效的转染。抑制网格蛋白介导(Clathrin-mediated endocytosis, CME)的内吞抑制剂包括：氯丙嗪(Chloropromazine, CPZ)和高渗葡萄糖；抑制陷穴小泡介导的内吞(Caveolae-mediated endocytosis, CvME)抑制剂包括非律平(Filipin Ⅲ)和Genistein;抑制巨胞饮(Macropinocytosis)的抑制剂包括5-(N,N-Dimethyl) amiloride hydrochloride (DMA)。抑制某一内吞途径后,测定复合物在细胞内的摄取和转染效率。结果表明CME内吞抑制剂高渗葡萄糖和氯丙嗪以及CvME内吞抑制剂FilipinⅢ和Genistein分别对复合物的摄取和细胞内的转染效率均有不同程度的抑制作用；巨胞饮抑制剂DMA对复合物的摄取和转染效率没有显著影响。据此推断复合物通过CME和CvME两种内吞途径进入细胞,且两种内吞均能导致有效的转染；巨胞饮途径则不参与复合物的摄取和转染。为了进一步证明这一推断,分别对复合物和CME及CvME内吞标记物用荧光探针进行标记,用激光扫描共聚焦显微镜观察复合物进入细胞后与内吞标记物的共定位情况,证明了复合物主要是通过CME和CvME这两种途径进入细胞。内酶体-溶酶体系统、细胞骨架微丝和微管及摩托蛋白对细胞内的膜泡转运具有非常重要的作用。加入内酶体-溶酶体系统酸化抑制剂NH4Cl和Monensin、肌动蛋白解聚剂细胞松弛素D(Cytochalasin D, CytoD)、微管解聚剂诺考达唑(nocodazole, NCZ)和微管稳定剂紫杉醇(paclitaxel, PTX)、动力蛋白抑制剂原钒酸钠(sodium orthovanadate, SOV)和驱动蛋白Eg5抑制剂monastrol,测定细胞内绿色荧光蛋白的表达,考察它们对于复合物在细胞内转运的影响。结果表明内酶体-溶酶体酸化系统被抑制以后,复合物的转染效率急剧降低；细胞中加入肌动蛋白(actin)解聚剂后转染效率降低50%左右；微管解聚剂nocodazole使绿色荧光蛋白表达显著下降,而加入微管稳定剂paclitaxel后,细胞中绿色荧光蛋白的表达则几乎不受影响；加入原钒酸钠后细胞中转染效率降低35%左右,加入monastrol后绿色荧光蛋白活性基本没有变化。这些结果表明,内酶体-溶酶体系统、细胞骨架和摩托蛋白对于复合物在细胞内的转运具有非常重要的影响。为了进一步证明内酶体-溶酶体系统和微管参与了复合物在细胞内的转运过程,采用荧光共定位的方法考察了内吞复合物和内酶体-溶酶体系统的相对位置,结果显示复合物经由内酶体-溶酶体系统向细胞核转运。建立了黑色素瘤细胞B16F10皮下肿瘤模型和肺转移肿瘤模型,考察三元复合物在体内的转染效率。对于皮下瘤模型,体内表达结果显示,CM-PLH可显著提高虫荧光素酶基因在肿瘤部位的表达,三元体系蛋白表达量是二元体系的4倍。而在黑色素瘤的肺部转移模型中,三元载体系统在荷瘤肺中的转染效率是二元载体系统的4倍；而就三元复合物体系而言,虫荧光素酶在荷瘤鼠肺部的表达是健康鼠肺部的2.8倍。以上实验证明,CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物载体系统是一种安全、有效而且稳定的非病毒基因递送系统,为合理设计载体系统提供了新方法,也为进一步进行体内外研究奠定了基础。