论文部分内容阅读
研究背景:鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）已经成为一种威胁人类健康的致病菌。可引起多种类型的感染包括肺炎、菌血症、脑膜炎、创伤感染及尿道感染等。近年来多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌的出现为临床治疗带来极大困难。有报道显示由耐药性鲍曼不动杆菌造成的死亡率高达43%。疫苗是预防鲍曼不动杆菌感染的有效手段,其不受抗生素耐药性限制,可从源头上控制鲍曼不动杆菌感染。住院病人尤其是免疫力低下的病人包括重症监护室病人、老年病人等是鲍曼不动杆菌感染的主要人群。从入院到鲍曼不动杆菌暴露及感染的窗口期非常短,因此针对院内病人的鲍曼不动杆菌疫苗需要快速起效。目前,鲍曼不动杆菌疫苗研究处于实验室研究阶段,还无有效的快速起效的疫苗,并且疫苗的快速起效仍缺乏理论支撑。免疫系统分为获得性免疫和天然免疫,经典免疫学理论认为天然免疫能快速应答,但不具有记忆性;获得性免疫应答时间较长,具有记忆性,但免疫记忆的激发通常需要多次接种数周才能获得,不能满足鲍曼不动杆菌疫苗的目标人群的需求。新近研究显示天然免疫亦具有免疫记忆的特性,天然免疫记忆是指天然免疫细胞在初次感染（或免疫）后在表观遗传水平发生改变,当机体再次感染后,其可快速产生相对于初次刺激时更高强度的应答。天然免疫本身具有快速应答的特征,其经驯化后可形成记忆,可能为疫苗快速起效提供理论基础。我们首先以灭活全菌疫苗作为模型,通过比较不同的接种途径,缩短接种次数,探究疫苗是否可以快速起效,结果发现鲍曼不动杆菌灭活疫苗单次滴鼻免疫后2天即可引起快速高效的免疫保护,且7天时已呈现免疫记忆的特征,传统的免疫记忆理论难于解释,从天然免疫记忆的角度研究可能揭示鲍曼不动杆菌疫苗的快速起效的机制,并为新型快速起效疫苗的的设计提供了理论指导。研究目的:1.通过比较不同的接种途径,缩短接种次数,评价鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗在肺炎模型和菌血症模型中的免疫保护作用,明确其是否具有快速免疫保护效应。2.明确天然免疫记忆在鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速起效中的作用及机制。3.探究鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速免疫保护的广泛性,特异性,普遍性及老龄化对疫苗快速免疫保护作用的影响。研究方法:第一部分:鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速免疫保护效应研究1.鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗（IWC）滴鼻或肌注免疫小鼠三次、两次、或一次,免后7天气管插管攻毒致死剂量鲍曼不动杆菌LAC-4,观察小鼠生存率,评价不同免疫程序对IWC保护效应的影响。2.IWC单次滴鼻或肌注免疫小鼠后2天、7天、30天气管插管攻毒致死剂量LAC-4,观察小鼠生存率,明确IWC单次免疫保护效果的时效性。3.IWC单次滴鼻免疫小鼠后不同时间点攻毒,攻毒后24小时,检测细菌定植量和肺组织病理变化。4.IWC单次滴鼻免疫小鼠后7天气管插管攻毒致死剂量LAC-4,攻毒后24小时,ELISA检测肺组织及血清中细胞因子的表达;qRT-PCR检测肺组织趋化因子的表达;流式细胞术检测肺组织炎症细胞的数目,评价IWC单次滴鼻免疫对攻毒后炎症反应的影响。5.IWC单次滴鼻免疫小鼠后2天或7天腹腔攻毒致死剂量LAC-4,观察小鼠生存率,评价IWC疫苗单次滴鼻免疫在菌血症模型中是否具有快速免疫保护效应。第二部分:天然免疫记忆在鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速起效中的作用及机制1.鲍曼不动杆菌IWC单次滴鼻免疫小鼠后7天收集血清和肺泡灌洗液,ELISA检测IWC特异性的IgG和IgA水平,评价IWC疫苗快速免疫保护是否依赖于抗体应答。2.IWC单次滴鼻免疫WT小鼠及Rag1-/-小鼠,7天后气管插管攻毒致死剂量LAC-4,观察小鼠生存率。IWC滴鼻免疫Rag1-/-小鼠7天攻毒后24小时,RNA测序分析肺组织基因转录组,评价IWC疫苗快速免疫保护是否依赖于天然免疫应答。3.IWC疫苗单次滴鼻免疫Rag1-/-小鼠,RNA测序分析小鼠免疫后2天和7天肺组织基因转录组。IWC单次滴鼻免疫WT小鼠,免疫后0至7天,ELISA检测肺组织及血清中细胞因子的表达,流式细胞术检测肺组织中性粒细胞数目。免后7天气管插管攻毒致死剂量LAC-4,攻毒后0和4小时,流式细胞术检测肺组织炎症细胞的数目。攻毒后0和2小时,ELISA检测肺组织细胞因子的表达;qRT-PCR检测肺组织趋化因子的表达,分析IWC滴鼻免疫激发的天然免疫应答是否具有免疫记忆的特征。4.IWC单次滴鼻免疫Rag1-/-小鼠,分析小鼠免疫后7天肺组织TLR4表达;IWC滴鼻免疫WT小鼠,流式细胞术分析小鼠免疫后7天肺泡巨噬细胞TLR4表达水平;IWC免疫WT小鼠及TLR4-/-小鼠后7天气管插管攻毒致死剂量LAC-4,观察小鼠生存率;攻毒后24小时,检测细菌定植量;攻毒后4小时,流式细胞术检测肺组织炎症细胞的数目,分析TLR4在IWC滴鼻免疫快速保护中的作用。第三部分:鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速起效的特性研究1.鲍曼不动杆菌IWC（LAC-4）疫苗单次滴鼻免疫小鼠后7天气管插管攻毒致死剂量鲍曼不动杆菌临床菌株SJZ24或SJZ26,鲍曼不动杆菌IWC（ATCC17978）,IWC（SJZ09）,IWC（SJZ24）,IWC（SJZ26）疫苗单次滴鼻免疫小鼠后7天气管插管攻毒致死剂量鲍曼不动杆菌LAC-4,观察小鼠生存率,评价鲍曼不动杆菌IWC是否对鲍曼不动杆菌临床株具有广泛的保护效应。2.鲍曼不动杆菌IWC疫苗单次滴鼻免疫小鼠后2天或7天气管插管攻毒致死剂量铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌。铜绿假单胞菌IWC,金黄色葡萄球菌IWC或大肠杆菌IWC疫苗单次滴鼻免疫小鼠后2天或7天气管插管攻毒致死剂量鲍曼不动杆菌,观察小鼠生存率,评价鲍曼不动杆菌IWC快速保护效应是否具有特异性。3.小鼠于第0天单次滴鼻免疫铜绿假单胞菌IWC或金黄色葡萄球菌IWC或肺炎克雷伯菌IWC,于第7天气管插管攻毒致死剂量铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌或肺炎克雷伯菌,观察小鼠生存率,评价IWC的快速保护效应是否在鲍曼不动杆菌中独特存在。4.青年及老龄化小鼠气管插管攻毒LAC-4,观察小鼠临床体征及生存率。攻毒后24小时,检测细菌定植量及肺组织病理变化,确立老龄化小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型是否建立成功。青年及老龄化小鼠滴鼻免疫鲍曼不动杆菌IWC疫苗后气管插管攻毒致死剂量LAC-4,观察小鼠临床体征及生存率,评价老龄化对鲍曼不动杆菌IWC保护作用的影响。研究结果:第一部分:鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速免疫保护效应研究1.鲍曼不动杆菌IWC疫苗三次、两次、单次滴鼻或肌注免疫生存率均为100%,各免疫组生存率均显著高于未免疫组（0%）（P<0.01）,提示IWC疫苗单次滴鼻或肌注免疫均具有良好的免疫保护效果。2.IWC疫苗单次滴鼻免疫2天、7天、30天生存率均为100%,均显著高于未免疫组（0%）（P<0.01）。IWC疫苗单次肌注免疫2天生存率为0%,与未免疫组无显著差异（P>0.05）;肌注免疫7天或30天生存率均为100%,均显著高于未免疫组（0%）（P<0.01）,提示相比肌注免疫,滴鼻免疫可更快速的激发免疫保护。3.IWC单次滴鼻免后2天、7天、30天攻毒,攻毒后24小时,肺组织及血细菌定植量均显著低于未免疫组（P<0.01）,肺组织病理损伤显著轻于未免疫组。4.IWC单次滴鼻免疫7天后攻毒,攻毒后24小时,免疫组肺组织IL-6、IL-1β、TNF-α及血清IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达显著低于未免疫组;免疫组肺组织中性粒细胞数目及趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL10、CCL2的表达显著低于未免疫组,上述结果均有统计学意义（P<0.01）,提示IWC疫苗单次滴鼻免疫显著降低攻毒后24小时的炎症反应。5.菌血症模型中,IWC免疫2天或7天组生存率均为100%,均显著高于未免疫组（0%）（P<0.01）,提示IWC单次滴鼻免疫在菌血症模型中具有快速免疫保护效应。第二部分:天然免疫记忆在鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速起效中的作用及机制1.ELISA结果显示IWC疫苗单次滴鼻免疫后7天血清及肺泡灌洗液中IgA和IgG水平与未免疫组无显著差异,提示IWC疫苗快速免疫保护不依赖于抗体应答。2.生存率结果显示IWC疫苗在WT小鼠中和Rag1-/-小鼠中的保护率分别为100%和75%。RNA测序结果显示,Rag1-/-小鼠中,IWC疫苗在攻毒后24小时能显著降低炎症反应相关基因的表达,提示IWC单次滴鼻免疫介导的保护依赖于天然免疫反应。3.RNA测序结果显示,Rag1-/-小鼠中,IWC免疫后2天高表达的基因在免疫后7天恢复至初始水平。ELISA结果显示IWC疫苗免疫后1至4天,IL-6及TNF-α的表达和中性粒细胞数目增高,免疫后7天,IL-6及TNF-α的表达和中性粒细胞数目恢复至初始水平。攻毒后4小时,免疫组肺组织中性粒细胞和单核细胞的数目显著高于未免疫组;攻毒后2小时,免疫组肺组织炎症因子TNF-α和IFN-γ及肺组织趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL10、CCL2的表达显著高于未免疫组。上述结果均有统计学意义（P<0.01）,提示疫苗免疫后2天能激发免疫应答,而在免疫7天恢复至初始水平,攻毒后,免疫组的天然免疫应答显著强于未免疫组。此应答过程符合免疫记忆的模式:疫苗免疫后1至4天是免疫记忆驯化的过程（training stage）,此后处于免疫记忆状态（memory stage）,在受到相同抗原刺激的再应答阶段（recall stage）可快速产生更强的免疫应答。4.RNA测序结果显示,疫苗免疫后7天,TLR4的表达显著高于未免疫组。流式结果显示IWC免后7天肺泡巨噬细胞TLR4表达显著高于未免疫组。生存率结果显示IWC疫苗在WT小鼠中和TLR4-/-小鼠中的保护率分别为100%和0%。细菌定植量结果显示,攻毒后24小时,TLR4-/-小鼠免疫组肺和血细菌定植量显著高于WT小鼠免疫组（P<0.01）。流式细胞术结果显示攻毒后4小时,TLR4-/-小鼠免疫组肺组织中性粒细胞和单核细胞数目显著低于WT小鼠免疫组（P<0.01）。提示TLR4介导天然免疫记忆的形成及疫苗快速保护。第三部分:鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗快速起效的特性研究1.IWC（LAC-4）单次滴鼻免疫后7天SJZ24攻毒,免疫组生存率（100%）显著高于未免疫组（0%）。IWC（LAC-4）单次滴鼻免疫后7天SJZ26攻毒,免疫组生存率（80%）显著高于未免疫组（20%）。IWC（ATCC17978）、IWC（SJZ09）、IWC（SJZ24）、IWC（SJZ26）单次滴鼻免疫后7天LAC-4攻毒,IWC（ATCC17978）、IWC（SJZ09）、IWC（SJZ24）、IWC（SJZ26）免疫组生存率（分别为100%、100%、90%、100%）均显著高于未免疫组（0%）,上述结果均有统计学意义（P<0.01）,提示鲍曼不动杆菌IWC对鲍曼不动杆菌临床株具有广泛的保护效应。2.鲍曼不动杆菌IWC单次滴鼻免疫后2或7天攻毒铜绿假单胞菌,免后2天、免后7天组保护率分别为80%、20%;鲍曼不动杆菌IWC单次滴鼻免疫后2或7天攻毒金黄色葡萄球菌,免后2天、免后7天组保护率分别为100%、40%。鲍曼不动杆菌攻毒时,铜绿假单胞菌IWC免后2天、免后7天组保护率分别为100%、0%;金黄色葡萄球菌IWC免后2天、免后7天组保护率分别为100%、0%;大肠杆菌IWC免后2天、免后7天组保护率分别为75%、25%。提示IWC单次滴鼻免后2天介导的保护为非特异性,而免后7天介导的保护具有特异性。3.铜绿假单胞菌IWC、肺炎克雷伯菌IWC、金黄色葡萄球菌IWC在各自菌株攻毒中的保护率分别为100%、80%、20%。提示IWC单次滴鼻免疫介导的保护可能在革兰阴性菌中普遍存在。4.老龄化及青年小鼠感染鲍曼不动杆菌后,老龄化小鼠生存率（0%）显著低于青年小鼠（60%）。攻毒后24小时,老龄化小鼠肺组织、血、脾组织细菌定植量显著高于青年小鼠,肺组织病理损伤较青年组更为严重。上述结果均有统计学意义（P<0.01）。提示老龄化小鼠对鲍曼不动杆菌的感染更为敏感,老龄化小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型建立成功。单次滴鼻免疫1×107 CFU鲍曼不动杆菌IWC,IWC在青年及老龄化小鼠中的保护率分别为100%、0%。单次滴鼻免疫1×108 CFU IWC,IWC在青年及老龄化小鼠中的保护率分别为100%、40%。三次滴鼻免疫IWC,IWC在青年及老龄化小鼠中的保护率分别为100%、80%。提示老龄化降低IWC疫苗单次滴鼻免疫的快速保护作用,提高免疫剂量和免疫次数能增强IWC疫苗在老龄化小鼠中的保护率。研究结论:1.鲍曼不动杆菌IWC在肺炎和菌血症模型中均有快速免疫保护作用。2.鲍曼不动杆菌IWC通过介导天然免疫记忆的形成发挥快速免疫保护效应,疫苗的快速保护依赖于TLR4。3.鲍曼不动杆菌IWC对鲍曼不动杆菌临床分离株中具有广泛的保护,且免后7天介导的保护具有特异性,这种快速保护效应在革兰阴性菌中可能普遍存在。老龄化降低鲍曼不动杆菌IWC的快速保护作用。研究意义:本研究发现鲍曼不动杆菌IWC疫苗单次滴鼻免疫在鲍曼不动杆菌感染中介导快速且具有特异性的保护作用,这种保护作用依赖于天然免疫记忆。此研究为疫苗的快速起效奠定新的理论基础,并为快速起效的新型细菌疫苗设计提供了新思路。