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目的:新疆作为我国棉花主产区,对我国棉花产业有着举足轻重的影响。作为一个干旱缺水的地区,新疆的棉花在生长发育过程中极易受到干旱胁迫的影响,减少棉花产量及降低棉花品质。多胺被誉为第六大植物激素,在植物生长发育及逆境胁迫中有着重要作用,所以,探究多胺在棉花抵御干旱胁迫中的生物学功能具有重要意义。多胺氧化酶作为氧化分解多胺的一种重要的酶,控制调节植物体内多胺的动态平衡,能够在植物感知外界信号后迅速改变植物体内各种多胺的含量,来响应植物感知的信号。本研究将构建好的棉花GhPAO3基因过表达载体转化模式植物拟南芥,筛选出纯合转基因拟南芥株系作为实验材料,模拟干旱条件下种子的萌发及生长状态观测,初步分析棉花GhPAO3基因在抗旱方面的功能,为棉花在抗旱分子育种及棉花多胺氧化酶功能研究方面提供一定的基础。
方法:本研究通过农杆菌转化法得到转基因拟南芥。利用纯合体拟南芥观察模拟干旱条件下的种子的萌发与植株生长状态,鉴定该基因在植物响应干旱胁迫时的功能;利用基因编辑技术,构建敲除GhPAO3基因的编辑载体,以期后续实验能验证该基因在棉花抵御干旱胁迫时的具体作用。
结果:(1)通过农杆菌转化获得转棉花GhPAO3基因的拟南芥,筛选出纯合体后测定多胺含量,结果表明该基因合成的多胺氧化酶是以精胺为反应底物。
(2)对三种材料拟南芥种子进行干旱处理,统计发芽势。实验结果表明在转入了GhPAO3基因后,提高了拟南芥种子在干旱条件下的发芽率。
(3)对三种材料拟南芥幼苗进行干旱处理,测定过氧化氢、内源多胺含量及抗旱相关标志基因的表达量,结果表明GhPAO3基因转入拟南芥后,降低了拟南芥幼苗抗旱能力,表明该基因在植物苗期干旱胁迫中起负调控作用。
(4)为了探究棉花GhPAO3基因在棉花中的作用,我们使用来自华中农业大学的CRISPR/Cas9表达载体pRGEB32-7作为基因编辑的载体,选择合适的靶点,设计引物,同时在设计引物时添加接头,利用重叠延伸PCR技术,将含有目标基因的小片段扩增出来,利用目的片段中含有的接头,连接两个小的目的片段。通过一步法将目的片段与经过单酶切后线性化的pRGEB32-7表达载体相连接,构建出敲除棉花GhPAO3基因的基因编辑的载体。以期验证该基因在棉花中响应干旱胁迫时的具体功能。
结论:本研究初步鉴定了棉花GhPAO3基因在拟南芥中响应干旱胁迫时的功能,研究表明该基因在转基因拟南芥处于种子时期受到干旱胁迫时,可以提高种子抵抗干旱胁迫的能力;在转基因拟南芥处于苗期受到干旱胁迫时,该基因会导致植株抗旱能力下降,起到负调控作用;利用基因编辑技术,构建了敲除棉花GhPAO3基因的基因编辑表达载体,以期在后续实验中,验证该基因在棉花响应干旱胁迫时的具体功能。
方法:本研究通过农杆菌转化法得到转基因拟南芥。利用纯合体拟南芥观察模拟干旱条件下的种子的萌发与植株生长状态,鉴定该基因在植物响应干旱胁迫时的功能;利用基因编辑技术,构建敲除GhPAO3基因的编辑载体,以期后续实验能验证该基因在棉花抵御干旱胁迫时的具体作用。
结果:(1)通过农杆菌转化获得转棉花GhPAO3基因的拟南芥,筛选出纯合体后测定多胺含量,结果表明该基因合成的多胺氧化酶是以精胺为反应底物。
(2)对三种材料拟南芥种子进行干旱处理,统计发芽势。实验结果表明在转入了GhPAO3基因后,提高了拟南芥种子在干旱条件下的发芽率。
(3)对三种材料拟南芥幼苗进行干旱处理,测定过氧化氢、内源多胺含量及抗旱相关标志基因的表达量,结果表明GhPAO3基因转入拟南芥后,降低了拟南芥幼苗抗旱能力,表明该基因在植物苗期干旱胁迫中起负调控作用。
(4)为了探究棉花GhPAO3基因在棉花中的作用,我们使用来自华中农业大学的CRISPR/Cas9表达载体pRGEB32-7作为基因编辑的载体,选择合适的靶点,设计引物,同时在设计引物时添加接头,利用重叠延伸PCR技术,将含有目标基因的小片段扩增出来,利用目的片段中含有的接头,连接两个小的目的片段。通过一步法将目的片段与经过单酶切后线性化的pRGEB32-7表达载体相连接,构建出敲除棉花GhPAO3基因的基因编辑的载体。以期验证该基因在棉花中响应干旱胁迫时的具体功能。
结论:本研究初步鉴定了棉花GhPAO3基因在拟南芥中响应干旱胁迫时的功能,研究表明该基因在转基因拟南芥处于种子时期受到干旱胁迫时,可以提高种子抵抗干旱胁迫的能力;在转基因拟南芥处于苗期受到干旱胁迫时,该基因会导致植株抗旱能力下降,起到负调控作用;利用基因编辑技术,构建了敲除棉花GhPAO3基因的基因编辑表达载体,以期在后续实验中,验证该基因在棉花响应干旱胁迫时的具体功能。