背景:随着社会发展,人类生活节奏越来越快,加之饮食结构改变和人口老龄化,胃肠动力障碍疾病对人类健康的影响也越来越显著,尤其是慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)的患者逐年增多,发病率逐年上升,严重的影响了人们生活质量。大量临床研究认为,慢传输型便秘(STC)的病因及发病机制与肠神经系统异常、结肠平滑肌异常、结肠Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICC)功能异常,精神心理等因素有关。目前临床治疗上,对于病情较轻的患者,采用改变生活习惯方式,通过饮食、行为疗法来改善患者排便习惯,对于采用非药物治疗效果不佳者,则给予药物治疗,常给予促动力药物和泻剂,如莫沙必利、乳果糖和聚乙二醇等。但对于部分患者尤其重度慢传输型便秘(STC)患者则疗效欠佳。传统中药番泻叶作为导泻剂,在我国已有千余年的应用历史,目前临床应用仍很广泛。大量的临床实践发现,番泻叶可促进胃肠蠕动作用对许多胃肠道动力障碍性疾病有较好的治疗作用。从目前人们研究来看,番泻叶分离成分中的番泻苷A、B、C、D是主要的导泻成分,其中番泻苷A和B互为同分异构体,且番泻苷A在番泻叶中的含量较多,相对易于提取。我们前期预实验发现,番泻苷A和番泻苷B对胃肠蠕动均有较为明显的促进作用,而且番泻苷A和番泻苷B不仅仅存在于番泻叶中,在大黄中也含有大量的番泻苷A和番泻苷B,所以,该类成分的开发存在潜在的市场利用价值,所以,进一步研究番泻苷A及番泻苷B促胃肠动力的作用机制,对于药物的开发具有十分重要的意义。我们前期预实验结果发现,番泻苷A的促胃肠动力效果显著优于番泻苷B,因此,对于番泻苷A的研究是我们研究的重点。大量研究表明,Cajal间质细胞(ICC)是胃肠道慢波节律的发起者和传播者,还参与胃肠神经递质信号转导,在胃肠动力形成和调控中发挥着至关重要的作用,同时Cajal间质细胞还参与胃肠感觉形成过程。近年来研究表明,Cajal间质细胞表面的超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(Hyperpolarization-activated cyclic Nucleotide-gated channels 1,HCN1)是其节律电活动的始发离子通道,目前尚不清楚Cajal间质细胞以及HCN1蛋白在慢传输型便秘(STC)形成过程中的作用。我们前期研究发现的番泻叶粗提物可以明显促进慢传输型便秘模型动物肠道蠕动,且番泻苷A是番泻叶发挥泻下通便作用的主要有效成分,但是作用机制不清楚。目的:针对以上的问题,本研究拟在成功制作慢传输型便秘动物模型基础上,采用免疫组织化学、药理学、电生理学等方法研究Cajal间质细胞及其功能蛋白HCN1在慢传输型便秘形成过程中的作用及其机制,同时研究番泻苷A在慢传输型便秘中的药理作用以及药理机制,为进一步阐明慢传输型便秘发病机制,以及为后续的研究番泻叶治疗慢传输型便秘奠定理论基础。方法:1.模型构建方法和药理学方法:(1)慢传输型便秘模型大鼠:采用冰水灌胃法构建;(2)特异性阻断剂:a通过腹腔注射STI-571来选择性抑制胃肠道Cajal间质细胞增殖,b通过尾静脉注射ZD7288来选择性阻断HCN1通道蛋白;(3)干预药物:番泻苷A、莫沙比利及生理盐水则通过灌胃方式给予。2.胃肠动力检测:采用肠道碳沫推进实验、结肠排珠实验在体检测肠道推进速率变化;采用肌条张力实验离体检测肠道收缩张力运动变化。3.采用免疫荧光染色方法检测胃肠道Cajal间质细胞形态学变化。4.采用膜片钳检测胃肠道Cajal间质细胞电活动变化。5.采用结肠球囊扩张给予机械扩张刺激,通过检测腹直肌电来评估胃肠道机械感觉敏感度。6.采用ELISA检测胃肠道神经递质分泌水平变化。结果:在第一部分实验中,我们主要的发现如下:(1)形态学实验显示,慢传输型便秘模型大鼠胃肠道Cajal间质细胞数目显著减少,Cajal间质细胞膜上HCN1表达减少。(2)在体实验显示,慢传输型便秘模型大鼠小肠、结肠推进速率均低于正常大鼠,而番泻苷A可以明显提高慢传输型便秘模型大鼠小肠、结肠推进速率,且效果优于莫沙比利,这一作用可以被HCN1特异性抑制剂阻断。(3)离体肌条实验显示,慢传输型便秘模型大鼠结肠离体肌条收缩幅度和频率均低于正常大鼠,而番泻苷A可显著提高慢传输型便秘模型大鼠结肠离体肌条收缩幅度和频率,这一作用可以被HCN1特异性抑制剂阻断。(4)膜片钳结果显示,慢传输型便秘模型大鼠胃肠Cajal间质细胞自发性去极化频率和幅度均低于正常大鼠胃肠Cajal间质细胞,而番泻苷A显著增加慢传输型便秘模型大鼠胃肠Cajal间质细胞自发性去极化频率和幅度,这一作用可以被HCN1特异性抑制剂阻断。在第二部分实验中,我们主要发现:(1)抑制Cajal间质细胞增殖或者阻断HCN1可以导致结肠机械感觉形成障碍,提示Cajal间质细胞参与胃肠道机械感觉的形成过程,而HCN1是这一过程的重要功能蛋白(2)机械扩张刺激可以促进肠道兴奋性神经递质SP、MOT释放,使抑制性神经递质VIP、CGRP释放受到抑制,提示机械性刺激可以调节胃肠神经递质释放;抑制Cajal间质细胞增殖或阻断HCN1可以显著削弱结肠刺激对肠内神经递质释放的调节作用,表明Cajal间质细胞可以通过介导肠内机械感觉形成来参与调节肠内神经递质释放的调节过程,而HCN1在这一过程中发挥重要作用。(3)慢传输型便秘模型大鼠肠道机械感觉较正常大鼠敏感性低,同时慢传输型便秘模型大鼠肠内兴奋性神经递质SP、MOT的水平低于正常大鼠,而抑制性神经递质VIP、CGRP的分泌水平高于正常大鼠,提示不同神经递质的作用是导致慢传输型便秘产生的较为重要原因。(4)番泻苷A可以提高慢传输型便秘模型大鼠肠道机械感觉的敏感性;还可提高慢传输型便秘模型大鼠肠内兴奋性神经递质SP、MOT的水平,进而降低抑制性神经递质VIP、CGRP的释放。但是这种机械感觉增敏作用以及神经递质调控作用可以被HCN1阻断剂所阻断。结论:(1)胃肠动力起搏细胞-Cajal间质细胞数目减少以及Cajal间质细胞起搏的始发离子通道HCN1表达减少所致的功能异常,均可以导致Cajal间质细胞自发性去极化的频率和幅度下降,进而导致慢波频率和幅度下降,由此直接造成胃肠道肌层收缩障碍而导致慢性便秘的产生;(2)Cajal间质细胞数目和功能异常还可以引起肠道机械感觉敏感性下降,造成肠内神经递质分泌调控异常,由此间接造成胃肠道肌层收缩障碍,这是导致慢性便秘的另外一个重要因素。(3)番泻苷A可以通过激活Cajal间质细胞膜上HCN1通道蛋白,一方面提高慢波频率和幅度,另一方面提高肠道机械感觉敏感度以及调节肠内不同性质的神经递质释放,最终达到对胃肠蠕动的调控作用。