水相体系中内源性蛋白酶水解芝麻蛋白的行为及其应用研究

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芝麻富含脂质和蛋白质,其加工偏重于制油。与多数植物蛋白不同,芝麻蛋白富含色氨酸和含硫氨基酸,极具开发利用价值。但是,芝麻蛋白由于水溶性差,加工利用程度低。水酶法技术在制取脂质的同时,还可实现油料蛋白的酶改性,从而实现脂质和蛋白质的综合利用。然而,酶制剂会提高加工成本,限制了水酶法技术的实际运用。本实验室前期研究已确认芝麻中含有高活性的内源性蛋白酶,因此,极具潜力用于芝麻的水酶法加工:在制取脂质产品的同时,利用内源性蛋白酶将芝麻蛋白生物转化成水溶性和营养功能性均佳的蛋白水解物。因此,本论文首先以芝麻浆为理论研究体系,系统考察内源性蛋白酶水解芝麻蛋白的条件和位点,及其在最佳水解体系中的蛋白质与脂质离心分离效果,对所得蛋白水解物和脂质组分进行成分和性质分析,并掌握内源性蛋白酶对芝麻蛋白的最大水解程度。在此基础上,考察了干燥温度对湿法脱皮芝麻中脂质性质和内源性蛋白酶活性影响,接着在低变性干燥条件下,制取了芝麻蛋白水解物,并对其蛋白成分进行分析。具体研究内容和结果如下:首先,考察了制浆方式对蛋白质与脂质提取及内源性蛋白酶活性的影响。结果表明,打浆机制浆时,蛋白质与脂质的提取率分别为78.76%和79.95%;而石磨制浆时,二者分别增至81.97%和89.73%。与打浆机相比,石磨制浆条件温和,能够更好地保留内源性蛋白酶活性。基于此,下面研究以石磨制取的芝麻浆作为研究体系。其次,考察了芝麻浆中内源性蛋白酶(包括内肽酶和外肽酶)的水解条件。结果显示,在p H 4.5、50℃下孵育6 h,且以HCl作为p H调节剂时,内源性蛋白酶对芝麻蛋白的水解程度基本趋于平衡,6 h后增加缓慢。在此条件下,用于表征内肽酶与外肽酶协同活性的TCA-NSI(三氯乙酸-氮溶指数)可达66.93%;Tricine-SDS-PAGE(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果显示,内肽酶主要水解水溶性差的11S球蛋白,其水解程度可达66.21%;游离氨基酸结果显示,外肽酶活性在p H 4.0~p H5.0时较高,p H 4.5时最高。然后,考察了内源性蛋白酶水解对于芝麻浆中脂质与蛋白质离心分离效果的影响。结果显示,芝麻浆、p H调至4.5的芝麻浆以及内源性蛋白酶在最佳条件下孵育的芝麻浆,经过离心(3000 g、5 min)均被分离成上浮物、中间相及沉淀三个组分,前两者的中间相中仅分布芝麻浆中13.22%~18.67%的蛋白质,并且还分布了18.32%~33.12%的脂质;剩余的蛋白质与脂质比较均衡地分布在上浮物和沉淀中。对于内源性蛋白酶处理的芝麻浆,离心后,高达71.02%的蛋白质(蛋白水解物)分布在中间相中,并且只分布了1.35%的脂质,中间相呈现澄清透明状;高达96.28%的脂质分布到上浮物中,沉淀量很少。接着,对上述内源性蛋白酶处理所得蛋白水解物的成分进行分析,基于此,探究了外肽酶(主要是丝氨酸羧肽酶)水解芝麻蛋白的位点。结果表明,蛋白水解物的主要成分为小肽(<1500 Da)和游离氨基酸,分别占水解物中蛋白成分的41.56%和35.46%。非酶切LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱联用)结果显示,在检测到的水解肽段中,11S球蛋白的水解产物占90.97%,而2S清蛋白和7S球蛋白的水解产物极少,与上述结果一致。根据各个游离氨基酸的释放量和芝麻浆中蛋白质所含各个氨基酸的含量,通过计算得出,丝氨酸羧肽酶对于肽段碳端的色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和亮氨酸具有优先水解趋势。另外,在考察蛋白水解物p H稳定性时发现,将p H调至7.0后,离心(3000 g、5 min),可沉降60.77%的植酸,而蛋白成分基本不受影响。最后,考察了干燥温度对湿法脱皮芝麻中脂质性质(压榨出油率和油的品质)和内源性蛋白酶活性的影响,为内源性蛋白酶的实际运用提供参考。结果显示,液压压榨(10 t,1 h)下,带皮芝麻与脱皮芝麻(低温干燥,50℃、4 h)的出油率(以带皮芝麻中的总脂质为100%)分别为81.58%和84.72%,表明脱皮有利于出油率的提高。湿法脱皮芝麻经过80℃~180℃干燥1 h后,出油率增至86.45%~90.25%;芝麻油酸价随干燥温度升高而增加(0.21 mg KOH/g~0.40 mg KOH/g),过氧化值则呈现先增后降趋势,140℃时最高(0.67 mmol/kg);上述酸价和过氧化值均在一级压榨芝麻香油的国家标准范围之内。对于内源性蛋白酶,在80℃~130℃时,其活性缓慢降低,在130℃时仍可保留约57%的活性,表明芝麻种子中内源性蛋白酶具有良好的热稳定性;130℃之后,活性下降较快,180℃时全部失活。为了利用内源性蛋白酶改性压榨粕中的蛋白质,先在50℃、4 h下干燥湿法脱皮芝麻,压榨制得芝麻油和低变性压榨粕,压榨粕制浆后在上述最佳条件下孵育,结果显示,离心后透明水相中的蛋白成分仍占浆液总蛋白的65.79%,水相中蛋白成分也主要由38%小肽(<1500 Da)和37%游离氨基酸组成。
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