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背景和目的:非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现。NAFLD与糖尿病关系密切,糖脂代谢异常导致肝细胞发生脂肪变性。因此,探索糖脂代谢异常的机制,为丰富NAFLD的发病机制及寻求新的治疗途径打下重要基础。碳水化合物反应元件结合蛋白(Carbohydrate responsive element binding protein,Ch REBP)是葡萄糖依赖脂质合成的关键转录因子,在糖脂代谢中发挥枢纽作用。Ch REBP诱导脂质从头合成关键酶-脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FASN)转录,促使葡萄糖向脂质转化。FASN基因转录的过度激活是导致肝细胞脂肪变性的重要分子事件。由于基因结构高度稳定且转录过程极其复杂,信号分子通常是在不影响基因DNA序列的前提下,通过改变染色质结构调控基因的选择性转录表达。组蛋白修饰作为表观遗传学的重要组成部分,通过影响组蛋白与DNA双链之间的亲和性,改变染色质的疏松或凝集状态,进而影响转录因子与靶基因之间的亲和性,但并不改变DNA序列,达到调控基因转录的目的。Ch REBP通过与FASN基因启动子区碳水化合物反应元件(Carbohydrate response element,Cho RE)结合,调控FASN基因的选择性转录。然而,有关Ch REBP调控FASN基因转录过程的组蛋白修饰事件仍不清楚。该研究对因FASN基因转录过度激活而引起的肝细胞糖脂代谢紊乱以及脂肪变性具有重要意义。鉴于此,本课题首先分析肝细胞FASN基因组蛋白修饰事件与基因转录的关系;进一步探讨葡萄糖-Ch REBP通路对FASN基因组蛋白修饰的影响;在此基础上,研究组蛋白乙酰化修饰对肝细胞FASN基因转录中的作用及脂质沉积的影响,为NAFLD的发病机制和治疗提供新的理论基础。方法:一、FASN基因启动子区组蛋白修饰与基因转录在肝细胞脂肪变性中的关系1、运用CCK8筛选人肝癌细胞株(HepG2)和人正常肝细胞株(L02)的最适葡萄糖终浓度。2、葡萄糖刺激HepG2和L02细胞0、24及48h后,或葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,即把含高浓度葡萄糖培养液更换为普通培养液,并在更换后的0、24及48h,运用Western-blot检测各时间点FASN蛋白表达。3、葡萄糖刺激HepG2和L02细胞0、24及48h后,使用TG测定试剂盒及油红O染色检测脂质沉积情况。4、葡萄糖刺激HepG2和L02细胞0、1、2、4、8、12、24及48h后,或葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,并在撤除刺激后的0、1、2、4、8、12、24及48h,用q RT-PCR检测FASN m RNA的转录时间谱。5、根据葡萄糖刺激或撤除刺激后肝细胞FASN m RNA转录时间谱,选取FASN m RNA开始发生稳定变化的时间点作为最佳时间点,用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)法检测该时间点的FASN基因启动子区组蛋白修饰事件。选择以下4个位点进行分析:Cho RE,promoter,第二外显子(exon2)和转录起始位点上游2000bp(-2kb)。二、ChREBP对FASN基因启动子区组蛋白修饰的影响1、葡萄糖刺激HepG2和L02细胞0、24及48h后,或葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,并在撤除刺激后的0、24及48h,用Western-blot检测各组细胞Ch REBP蛋白表达水平。2、葡萄糖刺激HepG2和L02细胞0、1、2、4、8、12、24及48h后,或葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,并在撤除刺激后的0、1、2、4、8、12、24及48h,用Ch IP测定Ch REBP-Cho RE结合时间谱。3、si RNA-Ch REBP质粒或Ch REBP-overexpression质粒瞬时转染HepG2和L02细胞,用Western-blot检测Ch REBP和FASN蛋白表达水平。4、HepG2和L02细胞分为4组:正常组(用普通培养液培养),阳性对照组(用高浓度葡萄糖刺激),转染组(转染si RNA-Ch REBP质粒48h后用高浓度葡萄糖刺激,或转染Ch REBP-overexpression质粒48h),阴性对照组(转染GV102-scramble质粒48h后用高浓度葡萄糖刺激,或转染p EX3-scramble质粒48h),用Ch IP检测FASN基因启动子区Ch REBP-Cho RE结合水平及组蛋白修饰事件。三、组蛋白乙酰化对肝细胞脂肪变性的影响HepG2和L02细胞分为3组:正常组(用普通培养液培养),葡萄糖+组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase,HAT)抑制剂组(同时用葡萄糖刺激及HAT抑制剂Garcinol处理24h),葡萄糖组(用葡萄糖刺激24h)。根据前期研究结果,选取5u M作为Garcinol处理肝细胞的终浓度。用Ch IP检测FASN基因启动子区组蛋白乙酰化及Ch REBP-Cho RE结合水平;q RT-PCR和Western-blot检测FASN m RNA和蛋白的表达水平;TG测定试剂盒及油红O染色检测脂质沉积情况;Western-blot检测Ch REBP蛋白表达水平。结果:一、FASN基因启动子区组蛋白修饰与基因转录在肝细胞脂肪变性中的关系1、CCK8结果显示:50m M和33m M分别是葡萄糖刺激HepG2和L02细胞的最适终浓度。2、Western-blot结果显示:与0h组相比,葡萄糖刺激HepG2和L02细胞24h和48h后,FASN蛋白表达水平明显升高,且随刺激时间延长而增加(p<0.05)。葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,与撤除刺激0h组相比,撤除刺激24h后FASN蛋白表达水平无明显变化(p>0.05),而撤除刺激48h后,FASN蛋白表达水平较撤除刺激0h和24h的则明显下降(p<0.05)。3、TG测定及油红O结果均显示:与0h组相比,葡萄糖刺激HepG2和L02细胞24h和48h后,TG含量及脂滴含量均明显升高,且随刺激时间延长而增加(p<0.05)。4、q RT-PCR结果显示:葡萄糖刺激HepG2和L02细胞,FASN m RNA转录水平与0h的相比,均在1h时出现显著升高(p<0.05),但至2h时其转录水平回落到0h时的水平(p>0.05)。随后,在葡萄糖分别刺激HepG2和L02细胞12h和8h时,FASN m RNA转录水平较0h的明显上升,且随刺激时间延长呈稳定上升的趋势(p<0.05)。5、q RT-PCR结果显示:葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,FASN m RNA转录水平的增长幅度与撤除刺激0h的增长幅度相比,均在撤除刺激1h时明显下降,且随撤除刺激的时间延长,增长幅度呈线性下降(p<0.05)。至撤除刺激48h时,FASN m RNA转录水平的增长幅度几乎接近于0,即FASN m RNA转录水平基本回落到基线水平。为后续Ch IP实验提供了最佳时间点。6、Ch IP结果显示:在葡萄糖分别刺激HepG2和L02细胞12h和8h时,FASN m RNA转录水平开始稳定上升。该时间点FASN基因启动子区Cho RE、promoter和exon2位点H3、H4乙酰化、H3K4三甲基化及H3S10磷酸化水平均较0h的明显升高(p<0.05),而H3K9和H4K20三甲基化水平较0h的则明显下降(p<0.05)。-2kb位点的组蛋白修饰事件与0h的相比无明显变化(p>0.05)。7、Ch IP结果显示:葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,在撤除刺激1h时,FASN m RNA转录水平的增长幅度开始稳定下降。该时间点FASN基因启动子区Cho RE、promoter和exon2位点H3、H4乙酰化、H3K4三甲基化及H3S10磷酸化水平的增长幅度均较撤除刺激0h时的增长幅度明显下降(p<0.05),而H3K9和H4K20三甲基化水平的增长幅度均较撤除刺激0h时的增长幅度显著上升(p<0.05)。-2kb位点的组蛋白修饰事件较0h的相比无明显变化(p>0.05)。二、ChREBP对肝细胞FASN基因启动子区组蛋白修饰的影响1、Western-blot结果显示:与0h组相比,葡萄糖刺激HepG2和L02细胞24h和48h后,Ch REBP蛋白表达水平明显升高,且随刺激时间延长而增加(p<0.05)。葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,与撤除刺激0h组相比,撤除刺激24h后Ch REBP蛋白表达水平无明显变化(p>0.05),而撤除刺激48h后,Ch REBP蛋白表达水平较撤除刺激0h和24h的则明显下降(p<0.05)。2、Ch IP结果显示:葡萄糖刺激HepG2和L02细胞,Ch REBP-Cho RE结合水平与葡萄糖刺激0h的相比,随着刺激时间延长几乎呈线性上升(p<0.05)。葡萄糖刺激HepG2和L02细胞48h后撤除刺激,Ch REBP-Cho RE结合水平的增长幅度与撤除刺激0h时的相比,随撤除时间延长呈线性下降(p<0.05)。3、Western-blot结果显示:抑制HepG2和L02细胞Ch REBP,FASN蛋白表达水平较正常组明显减少(p<0.05);过表达HepG2和L02细胞Ch REBP,FASN蛋白表达水平较正常组显著增多(p<0.05)。4、Ch IP结果显示:在葡萄糖刺激下,抑制HepG2和L02细胞Ch REBP,转染组与阳性及阴性对照组相比,FASN基因Ch REBP-Cho RE结合水平均明显下降(p<0.05),且启动子区H3、H4乙酰化、H3K4三甲基化及H3S10磷酸化水平也显著下降(p<0.05),而H3K9和H4K20三甲基化水平则明显上升(p<0.05)。转染组与正常组相比,FASN基因Ch REBP-Cho RE结合及组蛋白修饰事件均无明显差异(p>0.05)。转染组的-2kb位点组蛋白修饰事件与其余各组相比,差异无明显变化(p>0.05)。5、Ch IP结果显示:过表达HepG2和L02细胞Ch REBP,转染组与正常、阳性及阴性对照组相比,FASN基因Ch REBP-Cho RE结合水平明显升高(p<0.05),且启动子区的H3、H4乙酰化、H3K4三甲基化及H3S10磷酸化水平也明显上升(p<0.05),而H3K9和H4K20三甲基化水平则显著下降(p<0.05)。转染组的-2kb位点组蛋白修饰事件与其余各组相比,差异无明显变化(p>0.05)。三、组蛋白乙酰化对肝细胞脂肪变性的影响结果显示:葡萄糖+HAT抑制剂组与葡萄糖组相比,在葡萄糖刺激下抑制HepG2和L02细胞的HAT活性,使FASN基因组蛋白乙酰化水平下降(p<0.05),进而使FASN基因Ch REBP-Cho RE结合水平减弱(p<0.05),导致FASN m RNA和蛋白表达水平均显著减少(p<0.05),及肝细胞脂肪变性程度显著减轻,但Ch REBP蛋白表达水平未发生明显变化(p>0.05)。另一方面,葡萄糖+HAT抑制剂组与正常组相比,即使在葡萄糖刺激下抑制HepG2和L02细胞的HAT活性,FASN基因启动子区乙酰化及Ch REBP-Cho RE结合水平也是增加的(p<0.05),FASN表达水平及肝细胞内脂质含量均是升高的(p<0.05),且Ch REBP蛋白表达水平也是增加的(p<0.05)。结论:组蛋白H3、H4乙酰化、H3S10磷酸化及H3K4三甲基化促进FASN基因转录,H3K9及H4K20三甲基化抑制FASN基因转录。葡萄糖通过调控Ch REBP的表达水平及转录活性影响FASN基因的转录表达,其可能机制为Ch REBP通过诱导FASN基因H3、H4乙酰化、H3K4三甲基化及H3S10磷酸化,抑制H3K9、H4K20三甲基化,促进启动子区Ch REBP-Cho RE结合,发挥对FASN基因转录的调控作用。在葡萄糖刺激下抑制FASN基因HAT活性,并不能抑制Ch REBP表达,却通过阻遏Ch REBP与FASN基因启动区Cho RE结合,即降低Ch REBP转录活性,导致FASN基因转录下调及达到改善肝细胞脂变程度的目的,证明Ch REBP转录活性依赖于由组蛋白乙酰化引起的FASN染色质构象变化,提示组蛋白乙酰化可能是参与Ch REBP调控FASN基因转录表达的重要机制之一。