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目的:通过接种绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)感染山羊气管上皮细胞和SPF鸡胚,筛选致病力强的菌株,并进行人工感染试验,为Mo的病原学分析和致病力研究提供方法,为绵羊肺炎支原体疫苗研究提供数据支持。方法:(1)Mo黏附山羊气管上皮细胞的间接免疫荧光实验:用Mo感染山羊气管上皮细胞,Mo高免兔血清为一抗,FITC标记的山羊抗兔IgG为二抗,优化Mo浓度、黏附时间及一抗、二抗工作浓度;选FL3株、MoGH3-3株和A3株进行间接免疫荧光实验,荧光定量PCR测定3株菌的黏附率。(2)Mo人工感染SPF鸡胚实验:不同浓度Mo经由鸡胚卵黄囊和尿囊腔感染7日龄SPF鸡胚,观察记录鸡胚死亡情况。采集卵黄液和尿囊液进行Mo PCR鉴定和分离培养鉴定,确定Mo感染鸡胚的方式、感染剂量和分离培养最适样品。用FL3株、MoGH3-3株、A3株分别感染7日龄SPF鸡胚,统计鸡胚死亡率和分离培养结果。(3)Mo人工感染实验:用间接免疫荧光法和实验室鸡胚感染试验筛选的菌株,经由鼻腔和气管人工感染6只山羊,观察记录临床症状和剖检变化,间接ELISA测定血清中Mo抗体变化,HE染色法观察组织病理变化,免疫组化法观察肺脏中Mo分布情况,用荧光定量PCR方法检测并比较感染组肺脏、肝脏、肾脏和脾脏等组织中Mo的载荷量。结果:(1)筛选的间接免疫荧光法最优反应条件为:菌液浓度为1×10~8CCU/mL,粘附时间为2h,一抗工作浓度1:200,二抗工作浓度1:250;3株均能感染山羊气管上皮细胞且表现出不同强度的荧光,FL3株荧光强度>MoGH3-3株>A3株;FL3株对山羊上皮细胞的黏附力(6.35%)大于MoGH3-3株(5.12%)和A3株(3.12%)。(2)筛选的Mo感染鸡胚的最佳条件为:经卵黄囊接种0.2 mL的10~9CCU/mL的Mo,分离病原的最佳部位为卵黄液;3株Mo均能感染和致死亡鸡胚:其中FL3株致鸡胚死亡率为45%,高于MoGH3-3株(40%),二者均高于A3株(25%);FL3株感染的鸡胚卵黄液中分离培养阳性率为100%,高于MoGH3-3株(85%)及A3株(90%)。(3)FL3株感染后山羊出现体温升高,咳嗽、流鼻涕、精神沉郁等症状;感染后7d Mo血清抗体上升至阳性(OD≥0.3);剖检显示感染组1只羊肺脏尖叶肉变,1只羊肺脏与心脏和胸壁粘连,从感染组羊肺脏、鼻拭子、肺门淋巴结样品中分离到病原;HE染色观察到感染组羊肺泡隔增宽、肺泡和细支气管内有炎性细胞浸润等间质性肺炎病变;免疫组化结果显示Mo分布在肺脏的细胞质和细胞间质;qPCR检测结果表明感染组山羊的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏中Mo载荷量不同:肺脏显著高于肾脏、肝脏和脾脏(P<0.05)。结论:(1)筛选出对山羊气管上皮细胞黏附力较强菌株FL3株。(2)初步建立Mo鸡胚感染模型,使用该模型证实Mo FL3株对鸡胚的致病死率最高。(3)FL3菌株对山羊致病力强,与细胞黏附实验和鸡胚感染试验结果一致,可作为Mo疫苗研究的候选株。