目的:制备抗人GITRaa27-165(human GITRaa27-165,hGITRaa27-165)蛋白单克隆抗体(mAb)、纯化并鉴定其特性；用生物素标记其中的一株抗人GITRaa27-165蛋白单克隆抗体,构建生物素-亲和素-ELISA方法,检测hGITR蛋白,为进一步研究hGITR的生物学功能及临床应用奠定实验基础。　　 方法:本课题分三部分进行:　　 1.分泌抗人GITRaa7-165蛋白单克隆抗体的杂交瘤制备　　 将hGITRaa27-165蛋白与完全弗氏佐剂充分乳化后,免疫6～8周龄雌性BALB／c小鼠,眼眶后静脉丛采血获得抗hGITRaa27-165的抗血清,间接ELISA法检测其效价,以健康BALB／c小鼠血清为阴性对照。应用杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0融合,并通过间接ELISA法筛选阳性克隆杂交瘤细胞株,扩大培养、冻存并进行核型分析。　　 2.鉴定抗人GITRaa27-165蛋白单克隆抗体　　 将成功分泌抗人GITRaa27-165蛋白单克隆抗体的融合细胞注射健康BALB／c小鼠腹腔内,14天左右产生腹水。腹水经系列浓度梯度饱和硫酸铵初步纯化、透析、Protein G亲和层析柱进一步纯化后获得腹水型抗体。用间接ELISA法测定mAb的效价及类型,以Westernblot鉴定mAb的特异性。　　 3.构建检测hGITR蛋白的生物素-亲和素-ELISA方法　　 将2A5-C6 mAb与活化生物素BNHS耦联,制备生物素化抗体(Bio-2A5-C6 mAb),并以186-D9 mAb作为包被抗体,以Bio-2A5-C6 mAb作为检测抗体,确定最适的抗体包被浓度和一抗稀释倍数,构建生物素-亲和素-ELISA方法,检测原核表达蛋白hGITRaa27-165,确定检测hGITR蛋白的最低阈值。　　 结果:　　 1.以hGITRaa27-165蛋白为抗原对BALB／c小鼠进行皮下多点免疫,将hGITRaa27-165蛋白作为检测抗原进行包被,间接ELISA法检测其抗血清效价,效价可达1:1.28×105。杂交瘤细胞融合率为56％,经过间接ELISA法反复筛选,阳性率为18.75％,其中对2株杂交瘤细胞进行3次克隆化,分别命名为IB6-D9和2A5-C6。核型分析发现,抗hGITRaa27-165蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目在100条左右。　　 2.阳性杂交瘤细胞免疫小鼠后产生4～5 ml的腹水,经过分离纯化后,SDS—PAGE电泳分析表明,抗hGITRaa27-165蛋白单克隆抗体细胞株在52kD和23kD左右处各出现一条蛋白条带,与IgG的重链和轻链的大小相符。经间接ELISA法检测2株杂交瘤细胞诱生腹水中的抗体效价分别为1:2.56×105和1:5.12×105,抗体类型均为IgG。Western blot结果显示mAb均能与原核表达蛋白hGITRaa27-165特异性结合。　　 3.成功制备Bio-2A5-C6 mAb,确定了1B6-D9 mAb的最佳包被浓度为10ug／ml,Bio-2A5-C6 mAb的最佳稀释倍数为1:5000,最低检测hGITR的阈值为15.7ng,初步建立检测hGITR蛋白的BA-ELISA法。利用该方法检测梯度稀释的原核表达蛋白hGITR,结果显示吸光度随蛋白浓度呈现一定的线性变化。　　 结论:本研究通过杂交瘤技术获得2株能稳定分泌抗hGITRaa27-165蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该细胞株所分泌的单克隆抗体可与hGITRaa27-165蛋白特异性结合；利用单克隆抗体的高特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用,初步建立了高灵敏度的生物素-亲和素-ELISA方法。