金黄色葡萄球菌及其耐药株是引发化脓感染的一种常见病原菌,也是临床感染的高发菌株之一,可造成巨大的经济损失。传统抗菌方法如抗生素和中药治疗虽有一定疗效,但是也引发了很多问题。因此,寻找经济有效的治疗细菌感染的方法,改善患者的生活质量近年来逐渐成为治疗细菌感染性疾病的研究热点。本实验研究将光动力疗法PDT与治疗细菌感染相结合,选取临床感染常见病原菌金黄色葡萄球菌S.aureus及其多药耐药菌株MDR S.aureus作为研究对象,同时建立小鼠烫伤感染动物模型,通过酯键将疏水性光敏剂姜黄素Cur与水溶性高分子化合物羧甲基壳聚糖Cmcs连接,制得水溶性良好的光敏性羧甲基壳聚糖-姜黄素纳米材料Cmcs-Cur,研究光动力抗菌化学疗法PACT联合该纳米材料对S.aureus及MDR S.aureus的杀伤效果,并对其杀菌机制进行初步探究,为光动力抗菌化学疗法在临床的应用提供理论与实践基础。研究内容1.水溶性光响应纳米材料Cmcs-Cur的合成及表征以DCC、DMAP为催化剂,60℃水浴、避光条件下,将Cmcs与Cur通过酯键连接,制得水溶性光敏化材料Cmcs-Cur。通过标准曲线法计算合成产物中Cur的连接率为0.7%。激光粒度仪与透射电镜检测到Cmcs-Cur的粒径为110±20 nm,水溶性良好,合成产物中Cur的光谱学特性没有明显改变。2.离体条件下杀菌效果分析用平板计数法检测单独Cur、Cmcs-Cur、单独光照以及Cur联合PACT、Cmcs-Cur联合PACT对S.和MDR S.aureus的杀伤效果。结果表明单独Cur、Cmcs-Cur、单独光照对S.aureus和MDR S.aurms均无明显杀伤效果,Cur和Cmcs-Cur联合PACT后能明显杀伤S.aureus和MDR S.aureus。在相同Cur浓度条件下,Cmcs-Cur联合PACT的杀菌效果更明显,当Cur浓度为6 μg/ml,光照剂量为150 J/cm2时,杀菌效果达到99%以上。结晶紫染色法结果表明,在生物膜状态下,Cmcs-Cur-PACT 对 S.aureus 和 MDR S.aureus也有较好的杀菌效果。采用流式细胞仪和荧光显微镜检测Cmcs-Cur联合PACT处理后细胞膜通透性以及DNA损伤,结果表明PACT处理后,细胞膜通透性增强,细胞内容物外渗,细菌DNA损伤明显,以上效应均具有光照剂量依赖性。3.Cmcs-Cur联合PACT杀菌机制探究流式细胞仪分析Cmcs-Cur-PACT处理后胞内活性氧ROS产量,结果表明PACT处理能够刺激活性氧的产生,且作用效果具有光照剂量依赖性。实时荧光定量法分析PACT处理后活性氧靶基因Sta和SigB表达量的变化,结果显示联合处理后两种基因表达量显著下降,且与金黄色葡萄球菌致病力相关基因Toxin的表达量也显著下降。加入活性氧抑制剂NAC后,三种基因的表达量都有不同程度的上调,表明ROS确实能够调控这三种基因的表达。离体条件下用有机溶剂萃取PACT处理后金葡菌色素Sta的产量,结果证实联合处理能够有效抑制Sta的产生。4.Cmcs-Cur联合PACT在体抗菌效果探究选取5-8周龄,体重18-22 g雄性Balb/c小鼠为实验动物,建立烫伤感染模型。感染第三天开始治疗处理,处理每天一次,重复两次。在不同时间点处死小鼠,取感染部位皮肤,研磨匀浆,涂平板进行细菌计数,并通过伤口拍照、检测细胞因子评估愈合程度,最后进行体重监测、H＆E染色、溶血活性分析,皮肤毒性检测等进行安全性评估。结果表明,在体条件下,Cmcs-Cur-PACT能够有效杀菌,增强伤口愈合相关细胞因子的表达,促进感染部位伤口愈合,并且该处理方法安全有效,无毒副作用。结论:相对于Cur,本实验制备的Cmcs-Cur纳米材料水溶性良好,具有很好的光敏活性。在离体和在体条件下均表现出显著的杀菌效果,且安全无毒副作用,为光动力抗菌在临床的应用提供了数据支撑和实验基础。