复方马蹄香抗焦虑胶囊为纯中药复方制剂,由马蹄香(又名蜘蛛香Rhizoma Valeriana Jatamansi)、合欢皮(Cortex Albizia)、炒酸枣仁(the parched Semen Ziziphi Spinosae)和灯心草(Medulla Junci)组成,功能理气解郁、养血安神,临床观察及药理学实验均已证明有较强的抗焦虑作用,但体内药动学实验发现,该复方中有效成分在体内的吸收较低。由于口服药物制剂的吸收问题是决定制剂生物利用度的关键因素,同时脑部的血脑屏障又能把细胞间隙完全封锁,使药物很难到达脑腔内的靶部位。因此,研究该复方制剂中有效成分在生物屏障上的吸收转运机制对于提高该药的生物利用度显得非常有必要。近年来,随着动物和人体中转运蛋白分子鉴定的长足进展,人们发现转运蛋白对药物的分布、排泄甚至是代谢,起着至关重要的作用。这些种类多样的蛋白广泛分布在人体的肠道、肾脏、肝脏和脑毛细管内皮细胞,成为许多药物体内代谢动力学的重要影响因素,有学者将转运蛋白对药物的作用,称为药物的第三相代谢。P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是一种存在于细胞膜蛋白上的能量依赖性的转运蛋白,能够将许多不同结构的化合物逆向排出细胞,即“药物溢出泵”；现代药理多认为它是人体三相代谢酶的主要代表,对药物在体内吸收过程具有非常重要意义。对于P-gp的研究,现已广泛拓展到包括研究药物相互作用(drug-drug interaction DDI)、新药筛选等方面。因此,本课题基于对P-gp的认识,以复方抗焦虑胶囊中的主要有效成分橙皮苷、斯皮诺素、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称丁香树脂酚糖苷SAG)为主要研究对象,研究该复方中主要有效成分的吸收转运以及其联用的规律,并对其作用机制进行深入探讨,进一步阐明复方抗焦虑胶囊作用的主要物质基础及其联用机制。具体研究结果如下：1 研究了复方抗焦虑胶囊处方中主要成分的细胞毒性建立了较为稳定的Caco-2细胞模型和MDCK、MDCK-MDR1细胞培养和传代方法。Caco-2细胞以DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)培养,置于37℃、5% CO2条件下孵育细胞,生长状态良好,呈现铺路石状,透明度较高,折光性强。MDCK、 MDCK-MDR1以DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养,细胞彼此相嵌排列,连接紧密,透明度较高,折光性强,细胞生长状态良好,可以用于药物作用机制研究。研究了复方抗焦虑胶囊处方中主要有效成分的细胞毒性。在MDCK-MDR1和Caco-2细胞中,橙皮苷<200μg·ml-1,斯皮诺素<150μg·ml-1,丁香树脂酚糖苷<140μg·ml-1时细胞生存率超过90%,从细胞毒性试验可以看出,不同比例药物的细胞毒性不一,当处方中橙皮苷：斯皮诺素(5：1),橙皮苷：丁香树脂酚糖苷比例为(15：1),斯皮诺素：丁香树脂酚糖苷比例为(2：1)时,细胞毒性最小,细胞的生存率可能维持在比较高的比例。2研究了复方抗焦虑胶囊处方中主要成分的细胞摄取情况斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷在Caco-2细胞内的摄取较快,且摄取量与时间、浓度有关。在给药20 min后,斯皮诺素摄取量达到高点,当浓度高于80μg·ml-1时,斯皮诺素的细胞摄取量与浓度无关,呈现饱和趋势,提示与体内转运蛋白有关,可能在细胞内的吸收机制为主动转运。斯皮诺素与P-gp抑制剂联用后,摄取量显著增加。丁香树脂酚糖苷在细胞内的摄取在给药10 min达到高点,之后随着时间的延长反而有所下降,当与P-gp抑制剂联用时,细胞摄取量显著增加,说明丁香树脂酚糖苷的吸收与P-gp转运蛋白有关。因此,斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷是P-gp的底物,在细胞中的摄取受到P-gp外排的影响。复方中有效成分联用时,发现橙皮苷：斯皮诺素(5：1)时,斯皮诺素的摄取量达到(0.69±0.013)μg·mg protein-1,与单用斯皮诺素时有显著区别；橙皮苷：丁香树脂酚糖苷(5：1)时,丁香树脂酚糖苷的摄取量达到(3.01±0.26) μg·mg protein-1,与单用时有显著区别。在斯皮诺素：丁香树脂酚糖苷=(2：1)时,二者在Caco-2细胞中的摄取量与单用时相比有显著差异,提示联用有能增加药物吸收的作用。3研究了复方抗焦虑胶囊处方中主要成分单用及联用在Caco-2细胞和MDCK-MDR1细胞上的转运情况转运实验显示,在Caco-2细胞转运时,斯皮诺素给药浓度为2,10,40, 80μg·ml-1时,其转运方向为A→B,其表观渗透系数PappAP-BL分别为(1.36+0.41),(2.57±0.43),(12.4±1.98),(13.5±3.21)(10-6cm·s-1.),其外排率分别为0.005,0.04,0.135,2.84,从实验结果看出,在40μg·ml-1浓度下外排率均保持在0.2以下,但在80μg·ml-1时,其外排系数达到2以上,说明可能有外排蛋白P-gp的参与。当斯皮诺素与P-gp抑制剂联用后,和80μg·ml-1斯皮诺素单用时相比,药物外排率由2.84降到1.53,外排显著降低提示斯皮诺素的外排主要有P-gp外排所致,当斯皮诺素与橙皮苷联用后,和80μg·ml-1斯皮诺素单用时相比,药物外排率由2.84降到1.45,外排显著降低；斯皮诺素和丁香树脂酚糖苷联用后,相比于80μg·ml-1斯皮诺素单用时,药物外排率由2.84降到1.67,外排率显著降低。在MDCK-MDR1细胞转运时,当给药浓度在80μg·ml-1斯皮诺素单用时,药物的Papp (A→B)为12.7x10-6cm·s-1,显示较高的大脑透过能力,但其外排比率大于2,说明有P-gp的参与。但在与橙皮苷、丁香树脂酚糖苷联用时,以及斯皮诺素、橙皮苷、丁香树脂酚糖苷三药联用时,药物的外排率变为1.25,1.12,0.99,较单用时的2.09有显著下降,提示药物联用可以降低P-gp对斯皮诺素的外排作用,从而提高该药在脑内的吸收。4进行了复方抗焦虑胶囊处方中主要成分转运作用机理研究考察药物对血脑屏障紧密联接蛋白actin的影响,实验结果显示,药物单体丁香树脂酚糖苷、斯皮诺素浓度为150μg·ml-1时,血脑屏障紧密联接蛋白actin出现空洞,F-actin荧光减弱,细胞出现间隙,可能细胞紧密联接蛋白发生重排；斯皮诺素与橙皮苷配伍组高浓度时紧密连接蛋白变模糊,细胞间隙被打开。但在低于150μg·ml-1时,血脑屏障紧密联接蛋白actin联接紧密,无外观变化,说明药物在低浓度时可能以被动转运为主,而不通过细胞旁路进行吸收。流式细胞术检测结果表明,在Caco-2细胞中,斯皮诺素组、丁香树脂酚单体组荧光增强值分别为(119.94+3.54)%、(193.22土7.65)%,与空白组相比,能显著增加细胞的荧光强度(P<0.05),尤其是丁香树脂酚糖苷,显示出较强的抑制P-gp功能,而橙皮苷组与空白相比无显著差异。斯皮诺素和橙皮苷联用时,其荧光强度增加值为(125.19±2.34)%,较空白值也有显著的增加(P<0.05),丁香树脂酚糖苷和橙皮苷联用时,其荧光强度增加值为(167.55+5.67)%,较空白值也有显著的增加(P<0.05),说明药物联用后,都对P-gp表现出抑制的作用。通过分子对接技术,对橙皮苷、斯皮诺素和丁香树脂酚糖苷进行分子模拟,发现这三种药物和P-gp都有结合位点。橙皮苷、斯皮诺素具有相同的氨基酸残基PHE332、 SER725,橙皮苷、丁香树脂酚糖苷具有相同的氨基酸残基TYR306、SER725,斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷具有相同的氨基酸残基SER725、TYR303。三者均可与P-gp形成较强的氢键,当三者联用时,它们具有相同的氨基酸残基SER725。对P-gpATP酶活性研究发现,不同浓度的斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷对P-gp上的ATP酶活性都有抑制作用,且随浓度的增加其抑制作用有明显增强。同时,从实验结果可以看出,当药物不同比例联用时,对P-gp上的ATP酶活性呈抑制作用,且和空白组相比有显著差别(P<0.05)。5采用单向肠灌流法检测复方抗焦虑胶囊处方中主要成分单用与联用的吸收情况采用摇瓶法对斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷的油／水分配系数进行测定,从实验结果上看,斯皮诺素和丁香树脂酚糖苷的logP<1,落在最佳吸收范围内,从化学结构角度看,这两种有效成分属于易吸收药物。采用在体单向肠灌流法研究斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷在大鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收,发现二者在肠段内都有饱和现象,与P-gp抑制剂联用后,其在十二指肠,空肠,回肠的吸收速率较单用组都有显著增加,从体内实验角度验证斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷的吸收与P-gp相关。同时,药物联用后,都显著增强药物在肠道的吸收。总结：本文基于对P-gp转运体的认识,从体外细胞实验考察复方抗焦虑胶囊中有效成分的吸收转运规律,通过细胞机制研究发现,复方中有效成分斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷是P-gp的底物,与P-gp抑制剂联用后能增加药物的吸收,同时橙皮苷与之联用后能显著增加药物的吸收,其机制主要是通过与P-gp上的氨基酸位点相结合,抑制P-gp ATP酶活性,降低P-gp对药物的外排,从而增加其吸收。通过在体单向肠灌流实验验证药物在体内的吸收,研究结果表明,斯皮诺素、丁香树脂酚糖苷在体内的吸收与P-gp有很大关系,且药物联用后能显著降低P-gp对药物的外排,增加药物的吸收。