论文部分内容阅读
盐胁迫是影响全球作物产量的主要非生物胁迫之一。随着人口的增加,开发和利用现有的盐渍化土地刻不容缓。红树植物秋茄(Kandelia candel(L.)Druce),一种主要分布于海岸潮间带的非泌盐木本植物,常年遭受盐水的浸渍,已进化出一套适应盐水环境的耐盐机制,因此它是研究木本植物抗盐机制的经典材料。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA),是一种四碳非蛋白质氨基酸,当植物处于逆境胁迫时,体内GABA含量会大量积累。本文以秋茄幼苗为试验材料,添加Ca2+螯合剂乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)或Ca2+载体糖醇钙的高盐溶液处理幼苗,以未添加EGTA、糖醇钙的高盐溶液和无盐溶液处理的幼苗为对照组,研究高盐胁迫下Ca2+影响秋茄GABA积累的分子生理机制。(1)应用高效液相色谱(HPLC)技术测定各处理下秋茄叶片GABA含量,结果发现4 mM Ca2+处理下秋茄叶片GABA含量最高,10 mM EGTA处理下秋茄叶片GABA含量最低。(2)应用双向电泳(2-DE)和MALDI-TOF/TOF-MS鉴定技术对10 mM EGTA和4 mM Ca2+处理下秋茄叶片进行蛋白质组分析,共检测到600多个蛋白,其中有35个蛋白表达量变化在2倍以上,31个蛋白被成功鉴定。根据蛋白质的功能,这些蛋白主要参与光合作用(39%),分子调控(16%),GABA 合成(4%),TCA 循环(3%),解毒抗氧化(13%),分子伴侣(6%),转录与翻译(3%),ATP合成(4%)等生理过程。其中,参与光合作用的蛋白所占比例最多,发现秋茄叶片在高盐联合Ca2+处理下时,参与碳反应的大部分蛋白呈上调表达趋势;参与GABA合成的蛋白在Ca2+处理下呈上调表达,而EGTA处理的结果则相反。(3)应用RT-PCR和RT-qPCR技术对参与GABA代谢相关的基因 GAD、GABA-T、SSADH、MDH、DAO、P5CS 和抗氧化相关基因APX、POD进行mRNA水平分析,结果发现GAD、MDH、APX、POD在Ca2+处理下表达量均提高,GABA-T表达量没有显著变化,SSADH表达量降低,而EGTA处理的结果则相反;在Ca2+处理下和EGTA处理下DAO表达量均降低,P5CS表达量均没有显著变化。(4)对生理指标参数GAD、DAO、P5CS、POD、SOD的活性和脯氨酸、H2O2、O2-、ASA的含量进行测定,结果发现GAD、POD、SOD活性和ASA含量在Ca2+处理下显著提高,在EGTA处理下则显著降低;DAO活性在Ca2+处理下和EGTA处理下均显著降低;脯氨酸含量和P5CS活性在Ca2+处理下和EGTA处理下没有显著变化;H2O2和O2-含量在EGTA处理下显著提高,在Ca2+处理下则显著降低。综上所述,对不同Ca2+处理下的秋茄叶片中GAD和P5CS蛋白水平、生理水平和转录水平分析,并结合GABA含量和脯氨酸含量分析,推测秋茄叶片在高盐处理下通过积累GABA来减轻植物伤害,而不是积累脯氨酸;对GABA支路中相关基因GAD、GABA-T、SSADH、MDH、DAO的表达量分析以及GAD和DAO活性测定结果表明秋茄叶片在高盐处理下GABA含量的累积主要是因为通过Ca2+加强了GABA支路的代谢途径;对不同Ca2+处理下的秋茄叶片中活性氧含量、抗氧化酶活性及抗氧化剂含量的分析结果表明施加Ca2+可以减少活性氧含量,增强秋茄叶片的抗氧化能力,提高耐盐性,施加EGTA则结果相反。总之,本文发现在高盐胁迫下Ca2+通过调节GAD的蛋白水平、mRNA水平以及酶活性加强GABA支路代谢从而累积GABA减轻盐对植株的伤害,同时抗氧化酶活性的增强以及抗氧化物含量的增加,进一步提高秋茄的耐盐能力。本文的研究发现在蛋白质水平、转录水平以及生理生化水平上为木本植物耐盐分子生理机制提供新的理论依据。