本研究分别从胚胎处理方法、培养液中成分以及不同饲养层及采用大鼠心肌条件培养基等对兔胚胎干细胞培养时的影响进行比较,发现胚胎分割法和pronase E处理粘蛋白及部分透明带的胚胎容易贴壁和增值,分离出的内细胞团易生长于小鼠成纤维细胞饲养层上,消化后能够生长出ES细胞样的细胞集落。添加白血病抑制因子和胰岛素利于抑制ES细胞的分化和促进ICM的增值。SD大鼠心肌条件培养基在兔胚胎干细胞分离培养过程中效果较好,所分离的兔胚胎干细胞集落具有岛屿状生长特征,碱性磷酸酶染色为强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞,经过常规冻存后再传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长特征,并皇现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态。试验结果如下:1.分别采用pronase E对不同胚龄(3.5d、4d、4.5d及5d)的兔胚胎消化掉粘蛋白及部分透明带后进行了培养(MEF饲养层)。结果表明,3.5d、4d、4.5d的胚胎处理后,ICM在24～72h孵出并贴壁,其中,4d的囊胚内细胞团贴壁最早,且细胞增值良好。5d胚胎冲出时已经扩张,24h之内ICM就已孵出,但贴壁和增值情况较差。2.分别在不同饲养层上对兔胚胎进行培养。结果显示,无饲养层中培养的胚胎脱带率较低,在兔原代成纤维细胞和小鼠原代成纤维细胞饲养层上,胚胎的脱带率差别不大。而不同的饲养层上胚胎的贴壁率差别较大,无饲养层中ICM几乎不能贴壁,且贴壁的少量胚胎,ICM增值较慢且容易分化。在兔胎儿原代成纤维细胞饲养层上培养的胚胎,贴壁后增值较慢。而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上兔胚胎易扩展,脱带率和贴壁率都较高,而且贴壁后ICM增值较快,生长良好。故此后的实验均采用小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层。3.对兔胚胎进行不同方法处理。结果显示,所得不同状态的胚胎,其贴壁率不同。兔囊胚不经处理直接培养,经7-8d才有少数胚胎贴壁,贴壁率极低。去除黏蛋白及部分透明带的胚胎24h后ICM就能部分孵出,72h后完全孵出。经胚胎切割后,ICM可在48h内贴壁,能保持较快的增殖速率,贴壁率提高。ICM集落呈扁平圆形单层集落,细胞之间界限不清。用胰酶消化传代后,ES集落较小,呈微隆起椭圆状集落、颜色较暗。4.本实验中分别在培养液中添加不同浓度的LIF因子(0.01、0.1、1、10ng/ml),结果显示,在饲养层上培养时,ES细胞贴壁、增值和抑制分化方面差异不显著;而在无饲养层培养液中培养时,0.1ng/ml和1ng/ml两种浓度的LIF使ES细胞生长良好。5.添加胰岛素(64%)与对照组(63%)相比,ES细胞贴壁率差异不显著(P＞0.05).6.采用大鼠心肌细胞条件培养液培养兔胚胎可明显提高胚胎的ICM贴壁率,最高可达59%,与对照组(ES培养液,添加10μg/mL牛胰岛素)差异显著(P＜0.05)。传代后24h可出现ES集落,而对照组(ES培养液,添加10μg/mL牛胰岛素)需48h以上,而且使用大鼠心肌细胞条件培养液后ES细胞的连续传代能力与对照组相比增强。7.对兔类胚胎干细胞进行鉴定,结果显示,对第1、3、5代ES集落进行碱性磷酸酶染色,ES集落均呈强阳性。对稳定传代的第5代ES集落随机取样,4个样本的二倍体核型正常率分别是78%、81%、76%和85%,平均值为80%,二倍体核型正常率大于75%,三个为XY型,1个为XX型。