猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一类重要的人畜共患病原菌,是猪链球菌病的主要病原。它能够导致多种疾病包括脑膜炎、关节炎和败血症等,不仅给养猪生产业造成巨大的经济损失,也给相关从业人员的健康造成了巨大的威胁。依据其表面荚膜多糖(CPS)的差异,猪链球菌通常可分为35种不同的血清型(即1-34型和1/2型),其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是临床分离率最高和致病力最强的血清型,已在世界范围内引起了较大关注。到目前为止,国内外相继报道了 100多个与猪链球菌致病性相关的毒力蛋白,其中至少有37个被报道为关键的毒力因子。遗憾的是猪链球菌病的致病机理仍然不是很清楚。病原菌进入机体后,其表面蛋白可以与宿主细胞外基质发生相互作用进而黏附到宿主细胞表面,也可以与宿主免疫系统相互作用伪装成宿主组分逃避补体系统介导的吞噬杀伤。本研究中,我们利用二维电泳和免疫印迹(Far-Western blot)相结合的方法来大规模筛选SS2表面的宿主蛋白结合蛋白,包括细胞外基质蛋白(包括层粘蛋白和纤连蛋白)结合蛋白和H因子结合蛋白。然后对新鉴定到的蛋白进行结合特异性分析和基础生物学功能研究,为后续研究猪链球菌的致病机制提供理论依据。随后选取一些感兴趣且与猪链球菌毒力密切相关的宿主蛋白结合蛋白对其进行基因敲除,研究它们在猪链球菌致病过程中的作用,通过对这些蛋白的生物学功能解析,为猪链球菌的致病机制提供一些新观点。1猪链球菌2型LN和FN结合蛋白的筛选及功能分析细菌表面蛋白常常可以和细胞外基质蛋白(包括层粘蛋白和纤连蛋白)发生相互作用,它们在细菌侵袭和感染宿主细胞过程中发挥着重要作用。本研究中我们利用二维电泳和免疫印迹相结合的方法来筛选SS2表面的层粘蛋白(laminin,LN)结合蛋白和纤连蛋白(fibronectin,FN)结合蛋白。利用这种方法,共鉴定到15种潜在的LN结合蛋白和5种潜在的FN结合蛋白。选择新鉴定到的9种蛋白进行克隆表达,然后用ELISA和免疫印迹两种方法确定它们的结合特异性。结果显示OppA、EF-Tu、enolase、LDH和FBA同时具有LN和FN结合特性,随后制备了其中7种蛋白的兔多克隆抗体,并通过间接免疫荧光试验证实这7种蛋白都可以和HEp-2细胞发生黏附作用。此外,我们还检测了这7种重组蛋白和其对应抗体在细菌黏附过程中的贡献大小。结果发现其中4种蛋白在蛋白抑制和抗体抑制试验中均起到关键作用,表明这4种蛋白在SS2黏附到宿主细胞过程中发挥着关键作用。总的来说,我们鉴定到4种猪链球菌黏附素并证明二维电泳和免疫印迹相结合的方法是一个有价值的研究细菌与宿主相互作用的工具。2猪链球菌2型H因子结合蛋白的筛选及功能分析H因子(Factor H,FH)属于补体系统中的一个负调节因子,SS2表面的FH结合蛋白(FHBPs)可以特异性的结合FH,抑制补体替代途径C3b的活化,进而帮助SS2逃避由补体介导的先天免疫防御系统。本研究的目的是筛选新的FHBPs并探索它们在猪链球菌致病中的生物学功能。我们利用二维电泳和免疫印迹相结合的方法从SS2细胞壁蛋白中筛选到14种潜在的FHBPs,它们全部为首次报道。选择新鉴定到的8种蛋白进行克隆表达,并验证了它们与FH的结合特异性。结果表明SS2与FHBPs对应的抗体孵育后可以降低其与FH的结合能力,并首次发现SS2可以特异性结合鼠的FH。同时,FH也在SS2黏附和侵袭HEp-2细胞的过程中发挥着重要作用。另外,SS2孵育FH后可以增加小鼠血液和脑组织中的细菌载量。这项研究表明SS2结合FH后促进其对宿主细胞的黏附和侵袭能力,有助于抵抗宿主杀伤作用,增强致病力。3 MRP高变区在猪链球菌2型致病过程中的作用Muramidase-released protein(MRP)是SS2重要的毒力标志物且在SS2中广泛分布,但MRP的生物学功能还不是很清楚。分析发现,MRP在强毒菌株中高度保守,在弱毒株中同样也高度同源,但将强弱毒株一起比对后发现MRP在N端存在一段高变区(MRP-D1,a.a.242-596),在 C 端存在一段保守区(MRP-D2,a.a.848-1222)。我们推测SS2中MRP的高变区很可能与毒力密切相关。于是选取强毒株ZY05719和弱毒株SS26035作为模式菌株对MRP的生物学功能进行探索。通过经典同源重组方法分别敲除MRP的高变区、保守区和全长序列,结果发现强毒株中高变区MRP-D1在SS2黏附过程中发挥着决定性作用,强毒株的高变区比弱毒株高变区(MRP-D1*)结合宿主蛋白的能力更强,同时保守区MRP-D2不能够与宿主蛋白发生相互作用。证实强毒株的高变区MRP-D1是与宿主蛋白互作的重要功能域。细胞内存活试验、猪全血存活试验和小鼠动物模型均表明MRP-D1在SS2致病过程中发挥着重要作用。同时,动物保护试验证明MRP-D1对小鼠有一定的保护作用,可以作为重要的候选亚单位疫苗。以上试验表明,虽然mrp基因不能作为快速鉴定SS2毒力菌株的唯一标志,但mrp基因的高变区mrp-d1参与了 SS2的致病过程,能有效辨别SS2的致病性,为快速鉴定SS2菌株毒力提供依据。4 FBPS不是猪链球菌2型ZY05719的关键毒力因子Fibronectin-/fibrinogen-binding protein(FBPS)是 SS2 非典型的无锚微生物表面成分识别黏附基质分子(MSCRAMM),其在猪链球菌感染过程中的作用还不是很清楚。通过比较SS2强毒株ZY05719和缺失株△fbps的生物学特性,发现fbps的缺失对SS2的生长状态和细胞形态均没有显著影响。本文研究发现FBPS除了可以特异性结合FN、FH和纤维蛋白原(fibrinogen,FG)外,还可以与LN和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)发生相互作用。同时,FBPS在SS2黏附HEp-2细胞的过程中发挥重要作用。体外试验揭示将fbps失活后,SS2在巨噬细胞和猪全血中的存活能力和对宿主细胞的侵袭能力都没有显著变化。另外,小鼠模型和斑马鱼模型均表明敲除fbps对SS2的毒力没有显著影响。动物保护试验证明FBPS对小鼠没有明显的保护作用。这些结果显示FBPS不是猪链球菌2型ZY05719的关键毒力因子,提示前期研究发现的一些毒力相关蛋白并不一定是真正的毒力因子。5 PnuC在猪链球菌2型氧化应激和致病中的功能研究我们前期研究发现,PnuC特异性的存在于SS2强毒菌株中,是一个潜在的毒力相关蛋白。为了进一步验证PnuC的生物学功能,我们构建了以SS2强毒株ZY05719为亲本株的突变株△pnuC。通过比较ZY05719和△pnuC,发现敲除pnuC后SS2在摇动条件下生长变慢,但在静止条件下没有显著差异,另外△pnuC对H202的敏感性增加,这些结果暗示PnuC参与氧化应激耐受。斑马鱼感染模型证实pnuC+菌株的毒力水平明显强于pnuC-菌株的毒力水平。小鼠感染模型进一步确认敲除pnuC后SS2对小鼠组织器官的定植能力显著降低,脑组织病理学切片显示敲除pnuC后脑膜炎症状消失。另外,小鼠模型和斑马鱼模型均表明敲除pnuC后SS2的毒力显著下降。这些结果证实毒力相关蛋白PnuC在SS2感染过程中参与了氧化应激耐受和致病过程。