背景阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆最常见的类型,是一种严重损害患者记忆和认知功能的中枢神经系统退行性疾病。根据世界卫生组织2015年公布的流行病学统计数据显示,世界范围内已有超过47,000,000人罹患老年痴呆,并且这一数字预计将在2050年增长至三倍。阿尔兹海默病在世界范围内,给社会造成巨大的健康风险与经济负担,而目前尚无明确有效的根治方法。脑内β淀粉样蛋白(amyloid-β peptide,Aβ)的异常增多与过度沉积是AD的主要病因与病理学特征。Aβ的增多与沉积可以引起中枢系统神经炎症、氧化应激以及神经细胞自噬功能异常等病理学反应。这些病理反应不仅可以提示AD脑内的神经损伤情况,同时还会反向加重Aβ在脑内的增多与沉积。所以,针对AD不同的病理学反应,寻找有效的治疗方法,成为目前亟待解决的问题。许多研究表明,干细胞治疗可能成为治疗AD的有效途径。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)因其来源广泛、低免疫原性和较高的自我修复作用,成为干细胞治疗中的理想选择。在我们团队过去进行的研究中,已经证实人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC)在AD小鼠模型中可以有效减轻Aβ在脑内的异常沉积并且缓解其神经炎症反应。然而,hucMSC在临床应用中,具有运输难度大、难以保持其生物学活性、其作用成分量化困难等局限性,因此,我们需要寻找一种可以模仿hucMSC功能同时规避其局限性的有效“脱细胞”治疗方法。近年来,外泌体作为一个新型细胞外囊泡进入人们视野,由于其携带多种生物学活性物质且具有细胞间交流功能,科学家们预测,外泌体可能会成为理想的“脱细胞”治疗手段。大批研究团队已经证实,人脐带间充质干细胞来源的外泌体(hucMSC-exosomes)由于具有特殊的形态学和功能学特征,因而参与了多种疾病的发生、进程以及临床治疗。HucMSC-exosomes是一种人脐带间充质干细胞分泌的微小膜泡,具有脂质双层膜结构,直径大约为30-150 nm,可以携带和传递人脐带间充质干细胞来源的重要的信号分子,如RNA、细胞因子和蛋白质等。可以与来源于不同组织、器官的细胞形成细胞间信息传递系统,在增殖分化、免疫调节、氧化应激等途径发挥重要作用。在临床应用中,hucMSC-exosomes除具有人脐带间充质干细胞所有优势外,还可以规避其临床应用中的局限性。HucMSC-exosomes易于量化、储存和运输。另外,hucMSC-exosomes被证实可以通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),实现外周循环与中枢神经系统的细胞间信息传递。然而,hucMSC-exosomes是否具有对AD的治疗作用,以及其作用机制仍然未知。它是否可以有效减轻A β在脑内的沉积?是否可以有效缓解AD的神经炎症和氧化应激呢?目的依据上述背景,本研究主要探究:1.对APP/PS1双转基因小鼠进行hucMSC-exosomes尾静脉注射,观察hucMSC-exosomes对小鼠认知功能和脑内A β沉积的改善作用。2.HucMSC-exosomes是否能通过改善神经炎症,从而促进A β的清除,发挥对AD的治疗作用。3.hucMSC-exosomes是否能通过改善氧化应激损伤,从而减少Aβ生成,发挥对AD治疗作用。实验方法1.取足月剖宫产胎儿的脐带组织,分离华通氏胶,培养原代人脐带间充质干细胞,并进行传代扩增。留取第3-5代细胞培养上清,提取hucMSC-exosomes,并进行hucMSC-exosomes的电子显微镜形态学观察、表面标志物CD9和CD63的Western Blot检测。2.为探究hucMSC-exosomes对AD动物模型的治疗作用,将6-7月龄APP/PS1双转基因小鼠分为hucMSC-exosomes注射组和对照组,注射组给予hucMSC-exosomes尾静脉注射(30μg/只),对照组给予同体积对照组溶液(100μl/只),每两星期注射一次,连续注射四次后,采用Morris水迷宫法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠以及野生组C57小鼠学习与记忆水平。硫黄素染色法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内老年斑沉积情况,ELISA法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内可溶性A β水平,Western Blot检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内NEP、IDE、BACE1、AβPP和CTFβ的含量。3.为明确hucMSC-exosomes是否可以缓解AD动物模型中枢系统神经炎症,采用免疫荧光染色法和荧光定量PCR法检测小鼠脑内小胶质细胞激活情况。ELISA法检测小鼠外周血及脑内炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量。4.为进一步探究hucMSC-exosomes是否可以调节小胶质细胞激活,体外培养BV2细胞,并用A β处理形成AD小胶质细胞模型,分为hucMSC-exosomes治疗组和对照组,hucMSC-exosomes治疗组培养基中给予hucMSC-exosomes(30μg/ml)处理24小时,用免疫荧光法和荧光定量PCR检测小胶质细胞激活情况,ELISA检测细胞培养上清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量。5.为明确hucMSC-exosomes是否可以改善AD动物模型得脑内氧化应激损伤,采用还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒检测治疗组和对照组小鼠脑内氧化应激损伤。6.为进一步探究hucMSC-exosomes在体外对神经细胞AD模型氧化应激的改善作用,采用Aβ处理的SH-SY5Y细胞,分为hucMSC-exosomes治疗组、对照组和空白对照组,hucMSC-exosomes治疗组培养基中给予hucMSC-exosomes处理24小时,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,GSH/GSSG、GPX、SOD、MDA检测试剂盒检测三组细胞的氧化应激水平。实验结果1.HucMSC-exosomes尾静脉注射对APP/PS1小鼠的治疗作用1.1在Morris水迷宫实验中,hucMSC-exosomes注射组小鼠相比于对照组,潜伏期缩短,穿越平台次数增多,并且在平台所在象限停留的时间更久。与野生组小鼠相比,hucMSC-exosomes注射组小鼠的潜伏期在第2、3天仍然较长,但第4、5天就表现为无明显统计学差异,而且在记忆测试中,hucMSC-exosomes注射组小鼠穿越平台的次数和在平台象限的停留时间,也与野生组无明显统计学差异。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射改善了AD小鼠的学习能力和记忆功能。1.2我们对AD小鼠的脑冰冻切片进行硫黄素染色,结果显示,相比于对照组,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑皮层区和海马区内老年斑面积有所减少。ELISA法检测两组小鼠脑内可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的水平,相比对照组,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的水平降低。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射减少了 AD小鼠脑内Aβ斑块的沉积,并且降低了可溶性Aβ的水平。2.HucMSC-exosomes可以调节神经炎症,促进Aβ的清除2.1我们采用Western Blot法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内NEP、IDE的含量,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内NEP、IDE含量增多。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射促进了Aβ的降解。2.2我们采用Iba-1免疫荧光染色,检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内海马区和皮层区小胶质细胞数量,结果显示,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内小胶质细胞总数减少。采用荧光定量PCR法检测M2型小胶质细胞标记物 YM-1、Arg-1、MRC1、FIZZ1 和 CD163 水平,结果显示hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内M2型小胶质细胞明显多于对照组。采用ELISA法检测小鼠外周血及脑组织内炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量,结果显示,hucMSC-exosomes注射组小鼠外周血及脑组织内促炎因子IL-1β、TNF-α含量较对照组减少,抗炎因子IL-10和TGF-β的含量较对照组增加。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射促进了小鼠脑内小胶质细胞替代激活,发挥免疫调节作用,减轻神经炎症。2.3我们使用Aβ25-35 peptide(20μmol/L)刺激BV2细胞,建立体外小胶质细胞AD模型,并将细胞分为hucMSC-exosomes治疗组(30μg/ml,24小时)和对照组,用免疫荧光法检测M2型小胶质细胞表面标志物Ym1,荧光定量PCR检测两组细胞内M2型小胶质细胞表面标志物Arg1和Ym1的含量,结果均显示hucMSC-exosomes治疗组细胞替代激活增多。采用ELISA试剂盒检测两组BV2细胞培养上清内炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量,结果显示hucMSC-exosomes治疗组细胞培养上清内促炎因子IL-1β、TNF-α含量较对照组减少,抗炎因子IL-10和TGF-β的含量较对照组增加。以上结果表明hucMSC-exosomes可以促进小胶质细胞替代激活,发挥免疫调节作用。3.HucMSC-exosomes在体内外均可改善AD氧化应激,减少Aβ的生成3.1我们采用Western Blot法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内BACE1、AβPP和CTFβ的含量,结果显示hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内BACE1含量减少,CTFβ含量降低。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射减少了Aβ的生成。3.2我们采用还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑组织内氧化应激水平,结果可见hucMSC-exosomes注射组小鼠脑组织内GSH/GSSG比值、GPX、SOD含量均相对于对照组增加,MDA水平降低。以上结果表明hucMSC-exosomes尾静脉注射减轻了AD小鼠脑内氧化应激损伤。3.3体外CCK-8实验显示hucMSC-exosomes干预可提高SH-SY5Y AD模型的细胞活性,另外GSH/GSSG、GPX、SOD、MDA检测试剂盒检测结果显示,hucMSC-exosomes体外干预可以改善AD神经细胞氧化应激。结论1.HucMSC-exosomes尾静脉注射可以改善AD小鼠认知功能,降低AD小鼠脑内Aβ斑块沉积和可溶性Aβ水平。2.HucMSC-exosomes在体内外均可以改善AD氧化应激损伤,提高细胞活力,降低AD小鼠脑内AβPP分解酶(BACE1)的含量,减少Aβ生成。3.HucMSC-exosomes可以在体内外抑制神经炎症,并且促进小胶质细胞替代激活,发挥抗炎作用,同时提高AD小鼠脑内Aβ水解酶NEP、IDE含量,促进Aβ的降解,从而减少脑内Aβ含量。意义本课题的研究使我们明确了hucMSC-exosomes在改善APP/PS1双转基因小鼠认知功能和Aβ沉积中的作用,并且从神经炎症及氧化应激方面探索了其治疗机制。为进一步探索hucMSC-exosomes在治疗AD中的应用,提供了重要帮助。