研究背景和目的:自20世纪50年代后期以来,心血管系统疾病的发病率逐年升高,其中往往都伴随很多凶险的并发症,严重威胁患者的生活质量和生命健康,是全球范围内医学研究领域亟待解决的重大公共卫生问题[1][2]。急性心肌梗死是心血管疾病中最危急的一种,因其发病过程凶险,死亡率高,常伴随多种并发症的发生。由于急性心肌梗死病因繁多,分子机制复杂,给它的预防、早期诊断和治疗都带来极大困难[3][4]。心肌梗死的发生是一个从心肌坏死到瘢痕修复的逐渐演进的过程,心脏经历了急性缺氧期、细胞坏死期、细胞增生期和瘢痕形成期[5]几个阶段。急性心梗患者体内中性粒细胞在循环系统中的数量或其体积的增加与梗死面积大小、左心室功能和临床结果呈正相关关系[6]。一旦梗死发生后,中性粒细胞迅速被募集到受损区域,负责维持最初的急性促炎反应。已经证明,中性粒细胞能够帮助巨噬细胞向修复表型转变,从而促进急性心肌梗死后的愈合阶段[7]。因此,急性心肌梗死的治疗应该考虑到中性粒细胞促炎和抗炎的双重效应。S100A12是一种新发现的钙粒蛋白,它在小鼠体内不表达[8],并主要分布于人的髓系细胞中[9]（尤其以中性粒细胞最多）。S100A12的作用包括提高趋化活性、诱导轴突生长、促进细胞因子产生等[10]。关于S100A12与免疫系统疾病、呼吸道和消化道炎症的研究报道很多,而其在心血管疾病中的作用和机制近些年才见发表[11]。本实验室前期研究发现S100A12可能作为一种新的生物标志分子,能在早期诊断急性ST段抬高型心肌梗死的发生[2]。因此,本研究尝试阐明S100A12在急性心肌梗死发生和发展中的作用,及其调控机制,为预防急性心梗后心肌细胞坏死、心肌细胞纤维化及心室重塑的发生提供新的实验依据和干预靶点。研究方法和结果:（一）S100A12特异性转基因小鼠制备及其对小鼠急性心肌梗死进程的影响1.构建转基因小鼠方法:委托南京大学-南京模式动物中心制备、繁育本项目需要的中性粒细胞特异性表达Lysozyme M promoter S100A12-TG转基因小鼠的模型,在本实验室继续饲养繁殖。2.建立急性心肌梗死小鼠模型方法:选择雄性10周（week,w）左右小鼠,以Lysozyme M promoter S100A12-TG转基因小鼠（TG）为实验组,以其同窝野生型（wild type,WT）小鼠为对照组,对冠状动脉左前降支进行结扎造模。假手术组（sham）与心梗手术组的操作步骤相同,只是暴露心脏后不扎闭血管。分别于心梗后1天（day,d）、3 d、7 d、14 d、28 d利用小动物超声检测心功能,检测不同时间点S100A12的表达水平,染色观察28 d后的心室重塑水平,检测小鼠心肌组织凋亡水平。结果:冠脉结扎术后小鼠心脏中S100A12的表达明显上调,且在1 d时表达最高。与WT组相比,TG组小鼠心功能损伤更严重,心肌坏死面积更大,心肌组织凋亡水平更重。3.急性心肌梗死后小鼠心肌组织中性粒细胞胞外诱捕网产生检测方法:应用Western blotting、免疫组织化学和荧光染色法检测心梗手术后不同时间点TG和WT小鼠心脏组织中中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）的产生情况。结果:冠状动脉结扎术后,NETs相关蛋白在心梗1 d时表达最高,然后随时间延长表达逐渐下降。且与WT组相比,TG组小鼠上述蛋白表达更多。4.腹腔注射NETs抑制剂Dnase I,观察Dnase I对S100A12引起的心梗损伤是否具有治疗作用方法:雄性10 w左右小鼠随机分为四组:WT+生理盐水（Saline）组、WT+Dnase I组、TG+Saline组和TG+Dnase I组。各组小鼠分别在行冠脉结扎术前一天开始到术后28 d为止,每隔一天腹腔注射Saline或Dnase I（10 mg/kg/d）。分别于心梗后3 d和28 d时检测小鼠心功能、心室重塑水平和心肌组织凋亡水平。结果:与注射Saline组相比,注射Dnase I组小鼠在心梗1 d时NETs产生减少、凋亡水平降低,且WT+Dnase I与TG+Dnase I两组降低至相似水平。TG+Dnase I组小鼠在心梗28 d后心功能有所恢复,左室纤维化面积略减少。（二）S100A12表达对中性粒细胞生物学功能的调控作用研究1.探究S100A12对小鼠原代中性粒细胞的影响方法:分别提取WT和TG组小鼠骨髓来源的原代中性粒细胞。通过Transwell实验观察细胞迀移能力,Western blotting检测NETs相关蛋白表达变化,荧光染色观察NETs形成情况和细胞内活性氧含量。结果:与WT组相比,TG组的原代中性粒细胞更易凋亡,细胞迁移能力更强,NETs相关蛋白表达更多,细胞内活性氧含量更高,免疫荧光染色及Sytox green染色显示NETs产生明显增加。2.探究在离体水平下,S100A12是否有调控NETs的作用方法:使用微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope,DIC）拍摄S100A12促进中性粒细胞产生NETs的实时动态过程。Western blotting和q PCR方法检测S100A12敲低和过表达对NETs相关蛋白产生的影响。结果:与对照组相比,S100A12刺激后的中性粒细胞立即出现扁平化,细胞粘附性增加,胞内更早出现空泡化,质膜通透性增强,解聚的染色质释放更快。抑制S100A12表达造成NETs产生减少;过表达的S100A12促进NETs形成增加。3.中性粒细胞内的S100A12表达量对共培养的心肌细胞凋亡水平的影响方法:中性粒细胞分别转染S100A12的小干扰RNA和过表达质粒后,与HL-1心肌细胞共培养,通过TUNEL染色和Western blotting检测共培养心肌的凋亡情况。结果:与对照组相比,与敲低S100A12的中性粒细胞共培养的心肌细胞凋亡水平下降,与过表达S100A12的中性粒细胞共培养的心肌细胞凋亡水平升高,当过表达S100A12的中性粒细胞加Dnase I处理后,与其共培养的心肌细胞凋亡水平下降到正常。（三）S100A12调控NETs形成的分子机制研究1.探究缺氧引起中性粒细胞内S100A12表达增加的作用及机制方法:中性粒细胞在缺氧不同时间后,Western blotting检测缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF1α）、Lysozyme、S100A12及NETs相关蛋白的表达情况。双荧光素酶报告基因实验检测HIF1α对S100A12基因的转录调节作用。比较敲低HIF1α后S100A12的蛋白水平和m RNA的变化。结果:在中性粒细胞中HIF1α、Lysozyme、S100A12及NETs相关蛋白均随着缺氧时间的延长表达逐渐增加;HIF1α是S100A12的重要转录因子。2.寻找中性粒细胞中介导S100A12调控NETs表达增加的受体分子方法:提取WT和TG组小鼠的原代中性粒细胞,检测两组间Toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）和晚期糖基化终产物受体（the receptor of advanced glycation end products,RAGE）的表达差异。转染过表达质粒和干扰RNA转染检测受体RAGE是否影响了NETs生成。结果:受体TLR4在两组原代中性粒细胞间的表达差异不大,受体RAGE在过表达S100A12组的蛋白和m RNA表达水平明显高于对照组。干扰RAGE表达后,NETs生成明显下降;过表达RAGE后,在S100A12刺激下MPO、cit H3及PAD4表达明显增加。3.筛选新的与S100A12相互作用的受体蛋白分子方法:应用串联质谱标签（Tandem Mass Tags,TMT）定量蛋白质组学比较WT和TG组间的差异表达蛋白,并在两组小鼠的原代中性粒细胞中验证靶蛋白的表达情况。利用激光共聚焦扫描显微镜检测靶蛋白和S100A12在细胞中的共定位关系,采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术验证靶蛋白和S100A12的相互作用。转染S100A12的过表达质粒和小干扰RNA后,检测S100A12是否影响靶蛋白的表达。结果:结合质谱分析和文献报道,筛选出膜联蛋白5（annexin a5,ANXA5）为可能与S100A12相关的靶蛋白并进行了验证。缺氧条件下,ANXA5的表达也明显增加。在共聚焦显微镜下观察到ANXA5与S100A12存在共定位,Co-IP实验验证了ANXA5与S100A12的相互作用关系。干扰S100A12表达时,ANXA5的蛋白及m RNA表达均下降;过表达S100A12后,ANXA5的表达显著增加。4.探究S100A12是否通过ANXA5调控RAGE受体表达,影响NETs产生方法:转染ANXA5的过表达质粒和小干扰RNA探究ANXA5是否影响RAGE和NETs相关蛋白的表达。接下来,利用RAGE的过表达质粒转染低表达ANXA5的中性粒细胞,观察过表达RAGE是否能恢复敲低ANXA5的影响。结果:低表达ANXA5时,RAGE、MPO、cit H3的蛋白及m RNA表达均下降;过表达ANXA5后,上述蛋白的表达水平均升高。而过表达RAGE能够恢复敲低ANXA5的影响。5.探究S100A12是否通过RAGE调控ANXA5受体表达,形成正反馈调控方法:应用RAGE的过表达质粒和小干扰RNA转染中性粒细胞后,利用Western blotting和q PCR实验验证RAGE是否影响ANXA5的表达水平。结果:低表达RAGE时,ANXA5的蛋白及m RNA表达均下降;过表达RAGE后,ANXA5的表达升高。6.寻找并验证介导ANXA5与RAGE正反馈调控的相关转录因子方法:从NCBI网站查找RAGE的启动子区域,通过PROMO、JASPAR、Gene Cards及UCSC网站联合预测RAGE的转录因子,并在过表达ANXA5的中性粒细胞中验证。双荧光素酶报告基因实验检验转录因子对RAGE启动子的激活作用。使用该转录因子的干扰RNA转染中性粒细胞,检测转染后RAGE的含量改变。查找ANXA5的转录因子方法同上。结果:过表达ANXA5后,转录因子STAT3表达增加,可以提高RAGE的转录活性;转录因子GATA1表达增加,可以提高ANXA5的转录活性。结论:1.在急性心肌梗死后,心肌组织内S100A12的含量在心梗后早期明显上升,1 d时表达水平最高;2.S100A12加重了急性心肌梗死后的心肌损伤,其机制可能与S100A12引起的NETs产生增加有关,腹腔注射NETs抑制剂Dnase I可明显减轻过表达S100A12组小鼠的心梗损伤;3.在细胞水平,缺氧条件下转录因子HIF1α引起S100A12转录活性增加;过表达S100A12可促进中性粒细胞形成NETs,这种效应是由RAGE受体介导的;4.转录因子GATA1引起ANXA5表达增加,ANXA5通过转录因子STAT3引起RAGE表达增加,进而促进了NETs产生。