真核表达载体pEGFP-PACAP的构建及其在3T3-L1细胞上的表达

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肌内脂肪含量是影响猪肉肉质性状的重要因素之一,增加猪肉中肌内脂肪含量成为现今猪育种领域的研究热点之一。脂肪细胞中甘油三酯积累量直观地反映了机体脂肪组织含量。此外,研究发现动物脂肪的沉积与脂肪代谢是受多种转录因子调控的复杂生理过程。垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)经胰岛素(insulin)和地塞米松(Dexamethasone,DXM)的诱导能够在短时间内产生环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP),促进前体脂肪细胞内脂肪形成。然而,PACAP对前体脂肪细胞内产生甘油三酯的作用还不清楚。  为探究猪PACAP基因的功能,本研究克隆了猪(Sus scrofa)PACAP基因(pPACAP)的cds全长531bp,研究其在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中的PACAP mRNA的表达规律;并构建了真核表达载体pEGFP-PACAP,转染至3T3-L1前体脂肪细胞,48h后检测3T3-L1前体月旨肪细胞中的pPACAP mRNA和pacap-EGFP融合蛋白的表达水平及其他脂肪合成基因如脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase,ACC)mRNA的表达水平。  在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中,PACAP mRNA随着脂肪细胞的成熟,其表达量逐渐上升,在第4天时,表达量最高,第8天时,约80%的3T3-L1前体脂肪细胞成熟,而PACAP mRNA表达量呈下降趋势;双酶切及测序结果表明成功构建了pPACAP基因的真核表达载体pEGFP-PACAP;真核表达载体转入培养的3T3-L1前体脂肪细胞中后,在荧光显微镜下,重组质粒组和空载体组均发出绿色荧光,且48h时转染效率最高,且PACAP、FAS、ACC mRNA表达水平均有显著提高(P<0.01),pacap融合蛋白的表达量呈上升趋势。  综上,本研究利用脂质体转染的技术介导猪PACAP基因过量表达,并在转录水平上初步探索了PACAP基因对甘油三脂调控的可能原因及其对一些重要的脂肪合成代谢相关基因的调控作用,首次研究了3T3-L1细胞中的甘油三酯的积累随PACAP基因表达量改变的情况。研究结果为体外研究PACAP基因对脂肪合成代谢及其机体代谢的调节机制奠定了基础,同时为进一步研究猪体内脂肪的形成与沉积提供参考。
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