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朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)可危害多种作物,是最重要的世界性经济害螨之一。该螨具有世代周期短、繁殖能力强等生物学特性,这种螨的特性加上长期以来化学杀螨剂的大量使用,使“3R”问题日益严重,因此迫切需要开发寻找高效低毒的新型螨类控制剂。植物源杀螨活性物质,易溶于水,对非标靶生物低毒,无残留,还可通过非目标生物体生物降解,因此,这些化合物成为新型螨类控制剂的重要选择对象之一。姜黄素(curcumin)主要提取于中药植物姜黄(Curcuma longa),研究发现,其对朱砂叶螨表现出较强的生物活性。天然产物农药研究室为验证姜黄素的杀螨活性,进行了大量的生物活性测定实验,发现经姜黄素处理后,螨出现大量失水、体表皱缩等死亡症状,这些症状表现说明姜黄素可能作用于螨的体壁结构。几丁质是螨体壁的主要组成成分,其合成和降解在螨的生长发育过程中有至关重要的作用。但是目前对姜黄素的致死机制研究多集中在解毒酶系活性的变化,而其对几丁质的合成和降解酶系的影响尚未研究报道。本研究以几丁质酶为切入点,从生理生化及分子水平两个方面研究了姜黄素处理下朱砂叶螨几丁质酶的变化,从而推测对几丁质降解的影响,以期为探明姜黄素对朱砂叶螨的作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.测定了姜黄素对朱砂叶螨雌成螨的触杀毒力,得到了各亚致死剂量利用玻片浸渍法测得姜黄素处理朱砂叶螨48 h后的毒力回归方程为y=-0.474+1.234x,LC50为2.424 mg/mL,95%的置信区间为1.715~3.733 mg/mL。48 h后的亚致死剂量即LC40、LC30、LC20、LC10分别为1.511、0.911、0.504和0.222 mg/mL。测定了各亚致死剂量姜黄素处理下对朱砂叶螨发育历期的影响。结果表明,朱砂叶螨卵期、幼螨期、若螨期和成螨期与对照相比总体上呈缩短的趋势,并无显著差异,但是雌成螨的平均寿命显著缩短。2.明确了朱砂叶螨几丁质酶的基本酶学性质利用改良的schales法,研究了朱砂叶螨几丁质酶的基本酶学性质,包括最适反应温度及热稳定性、最适反应pH及pH稳定性、金属离子对酶活性的影响和动力学常数Km值。朱砂叶螨几丁质酶的最适反应温度约为35℃,对高温比较敏感;最适反应pH约为7.0,在pH值为6.0时最稳定;金属离子对几丁质酶活性存在影响,大部分的金属离子对酶有较强的抑制作用,但也有少数的金属离子对酶有激活作用;水解胶状几丁质的Km值为5.15μmol/L。这些研究结果进一步丰富了螨类相关几丁质酶生物学特性研究,可为基于几丁质酶的杀螨剂筛选奠定理论基础。在测定了朱砂叶螨几丁质酶酶学性质的基础上,进一步测定了螨不同发育阶段酶活性的情况。分析结果表明,卵期酶比活力最低,若螨期酶比活力最高,且卵期和若螨期具有显著性差异。这可能因为幼螨和若螨期是螨蜕皮发育的阶段,急需几丁质酶发挥作用,促进几丁质的降解。用不同浓度姜黄素处理朱砂叶螨雌成螨24 h后,随着浓度的升高几丁质酶比活力不断降低,在2.0和4.0 mg/mL时与对照相比已存在显著差异,特别在4.0 mg/mL,对几丁质酶的抑制率达到了约32%。由此推测,姜黄素的杀螨作用机制可能与几丁质酶有关。3.克隆并分析了6条朱砂叶螨几丁质酶基因(chitinase,TcCHTs)的cDNA序列参考朱砂叶螨近缘种二斑叶螨(Tetranychus urticae)的全基因组信息,利用RT-PCR技术,克隆获得了6条TcCHTs的cDNA序列。这6条基因分别命名为TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3、TcCHT4、TcCHT5和TcCHT6,GenBank登录号分别为KT956964、KT956965、KT956966、KT956967、KT956968和KT9569692。6条几丁质酶基因的结构域存在差异:其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和TcCHT4推导的氨基酸序列含有一个信号肽、一个催化结构域和一个几丁质结构域,而TcCHT5和TcCHT6由跨膜域代替了信号肽。预测蛋白质分子质量分别为60.80、69.03、104.32、59.75、45.63和49.05 kDa,等电点分别为5.44、8.65、6.23、6.07、6.12和8.27。构建系统发育树,结果显示这6条基因与各自相对应的二斑叶螨基因聚在同一支上。4.测定了朱砂叶螨TcCHTs基因在不同发育阶段及姜黄素处理后表达量的差异在完成了对6条TcCHTs克隆与分析的基础上,利用RT-qPCR测定了其在朱砂叶螨不同发育阶段的表达量。结果显示,幼螨和若螨期的基因表达量显著高于卵期和成螨期,其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和TcCHT4 4条基因的这种差异更加明显,前者甚至高出后者近百倍。用不同浓度姜黄素处理朱砂叶螨若螨24 h后,6条基因的表达量均有不同程度的降低,其中TcCHIT1和TcCHT5的下降程度更加显著。