Sitagliptin通过JNK/c-Jun通路减弱缺氧环境下骨髓间充质干细胞的凋亡和自噬目的：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)已广泛应用于改善心肌梗死后的心肌修复,然而心肌梗死后心肌局部微环境恶劣,导致移植到心肌内的干细胞存活效率低,进而限制了干细胞移植疗效的发挥。肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂作为一类新型的糖尿病治疗药物,除了降糖作用之外,还具有心血管保护的多效性。研究显示DPP-4抑制剂可通过多种路径及机制发挥这些保护效应。既往的研究发现给予DPP-4抑制剂可增加MSCs动员到缺血心肌损伤处。那么,当MSCs动员或移植到心肌损伤后,DPP-4抑制剂对它们的影响如何,目前没有相关的研究。因此,本实验旨在通过模拟体内缺血缺氧环境,建立缺氧／无血清(Hypoxia and serum deprivation, H/SD)细胞培养模型,探讨Sitagliptin对缺血缺氧环境下MSCs的影响,并对其中的机制进行研究,初步假设是Sitagliptin通过JNK/c-Jun信号通路减弱缺氧环境下MSCs的凋亡和自噬,从而发挥保护作用。并进一步探讨Sitagliptin效应下凋亡和自噬的关系,明确两者之间是否存在交互调节。方法：分离并培养Sprague-Dawley大鼠的MSCs,将第三代细胞随机分为正常组(normal)、缺氧无血清对照组(H/SD)、不同浓度梯度Sitagliptin组(西格列汀0.001μM-10μM),观察西格列汀对缺氧无血清条件下MSCs的凋亡和自噬的影响,并测定了不同Sitagliptin浓度处理后MSCs的JNK与c-Jun磷酸化蛋白表达情况。为了进一步探讨JNK/c-Jun信号通路与Sitagliptin抗凋亡和抗自噬的作用的关系,我们分别在H/SD组及Sitagliptin1u M组中加入JNK抑制剂SP600125(注意：JNK抑制剂SP600125要提前孵育细胞后再进行后续的处理)。为了进一步验证Sitagliptin的抗凋亡和抗自噬作用的关系,我们分别在以1μM Sitagliptin和自噬抑制剂3-MA或自噬促进剂Rapamycin或Bc1-2抑制剂ABT-737共同处理MSCs,并观察H/SD条件下各组MSCs凋亡水平和自噬的变化。分别采用流式细胞仪检测MSCs的凋亡及自噬比例；蛋白免疫印迹法(Western bolt, WB)检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2自噬相关蛋白beclin1、LC3水平,JNK, c-Jun,总蛋白及其磷酸化的水平,透射电镜观察自噬体的形成。结果：H/SD条件下,无药物处理的缺氧对照组MSCs的凋亡和自噬水平增加,同时JNK、c-Jun蛋白磷酸化的水平增加。而Sitagliptin降低了H/SD诱导的MSCs凋亡、自噬水平及JNK、c-Jun蛋白磷酸化的水平。而当提前加入SP600125阻断JNK信号通路后,sitagliptin抑制JNK与c-Jun磷酸化、凋亡和自噬的效应减弱,提示sitagliptin至少是部分通过JNK/c-Jun信号通路起作用的。在探讨Sitagliptin的抗凋亡和抗自噬作用的关系的实验中,我们发现自噬抑制剂3-MA或自噬促进剂Rapamycin并没有对sitagliptin的抗凋亡能力有明显的影响,而Bcl-2抑制剂ABT-737则可显著增加MSCs的凋亡及自噬水平,提示Sitagliptin的抗凋亡作用可能是通过Bcl-2/Beclin1途径来调节细胞的自噬活性,Sitagliptin的抗自噬作用很可能是继发于其抗凋亡作用的一种效应。结论：Sitagliptin可以抑制缺氧环境下MSCs的凋亡和自噬,而这种保护作用的发挥至少部分是通过JNK/c-Jun信号通路起作用的。并且,Sitagliptin的抗凋亡效应可能通过Bcl-2/Beclin1途径调节缺氧环境下细胞的自噬。Sitagliptin通过激活JAK2/PI3K/AKT/STAT3通路抑制缺氧环境下骨髓间充质干细胞的线粒体凋亡途径目的：我们初步的实验发现Sitagliptin可以减弱低氧环境下骨髓间充质干细胞的凋亡。既往的研究显示DPP-4抑制剂可诱导心肌梗死后心脏保护基因及相关蛋白表达增加,并且此类药物通过缩短心肌有效不应期和减少梗死面积来稳定心脏缺血时的电生理状态,减弱缺血时心律失常的易感性,同时改善缺血再灌注时氧化应激所致的心肌细胞线粒体障碍,从而介导心肌保护作用,因此推断DPP-4抑制剂可能通过保护心肌线粒体功能进而发挥抗凋亡效应。JAK2/STAT3信号通路是一条细胞内重要的信号传导途径,参与细胞的生长、增殖分化、炎症、凋亡等多种生理和病理过程。Sitagliptin抑制低氧条件下MSCs凋亡是否与此信号通路有关,目前还不明确。既往研究显示DPP-4抑制剂可以通过PI3K-AKT路径调节NO的释放等进而改善血管的状态。JAK2/STAT3和PI3K-AKT信号通路在Sitagliptin抗凋亡效应中的关系如何,目前并不是很清楚。因此,本实验旨在通过模拟体内缺血缺氧环境,建立缺氧／无血清(H/SD)细胞培养模型,探讨Sitagliptin对缺血缺氧环境下MSCs线粒体凋亡途径的影响,并对JAK2/STAT3信号通路在其中的作用进行研究,另外,进一步探讨了此通路与经典通路PI3K/AKT的关系。方法：分离并培养Sprague-Dawley大鼠的MSCs,将第三代细胞随机分为正常组(normal)、缺氧无血清对照组(H/SD)、不同浓度梯度Sitagliptin组(西格列汀0.001μM-10μM),观察西格列汀对缺氧无血清条件下MSCs线粒体凋亡相关的早期改变,包括线粒体膜电位(JC-1)、线粒体膜通道孔(mPTP)开放程度。蛋白免疫印迹法(Western bolt, WB)方法检测不同Sitagliptin浓度处理后MSCs的JAK2/STAT3、PI3K/AKT磷酸化蛋白及凋亡相关蛋白bax、bcl-2,细胞色素C的表达情况。为了进一步探讨JAK2/STAT3与PI3K/AKT信号通路关系,我们分别在H/SD组及Sitagliptin1μM组中加入JAK2抑制剂AG490及PI3K抑制剂LY294002(注意：抑制剂要提前孵育细胞后再进行后续的处理)。结果：H/SD条件下,无药物处理的对照组的MSCs凋亡增加,同时JAK2/STAT3、 PI3K/AKT蛋白磷酸化的水平增加。而Sitagliptin可减少H/SD诱导的MSCs凋亡,并增加JAK2/STAT3、PI3K/AKT蛋白磷酸化的水平。而当提前加入AG490阻断JAK2信号通路后,sitagliptin增强STAT3、PI3K、AKT蛋白磷酸化及抑制凋亡的效应减弱,提示sitagliptin是通过JAK2/STAT3信号通路发挥抗线粒体凋亡效应。在探讨JAK2/STAT3与PI3K/AKT信号通路关系的实验中,加入PI3K抑制剂后,AKT及STAT3磷酸化程度减弱,但并没有对JAK2磷酸化程度有明显的影响,提示JAK2是PI3K/AKT/STAT3的上游分子。结论：Sitagliptin可以抑制缺氧环境下MSCs的线粒体凋亡途径,而这种保护作用的发挥是通过激活JAK2/PI3K/AKT/STAT3信号通路起作用的。